cas9论文谁发表的

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类器官 类器官（Organoids），是指利用成体干细胞（ESCs）或诱导式多能干细胞（iPSCs）进行体外三维（3D）培育的具有一定空间结构的组织类似物。类器官能高度模拟体内组织结构及功能并能够长期稳定传代培养。类器官模型是介于细胞系和动物模型之间的一种新型功能化体外模型，可用于解析遗传发育、建立疾病模型、筛选药物和检测毒性以及探索个性化医疗方案。迄今为止世界各国科学家陆续培养出脑、肝、胃、肺、肠、肾脏和胰腺等各种类器官。 2013年，类器官技术被《Science》评为十大科技突破之一，2017年，又被《Nature Methods》评为生命科学领域的年度技术（Method of the Year 2017）。 荷兰科学家Hans Clevers教授是类器官研究领域国际公认的先驱和鼻祖，早在2009年，Hans Clevers就发现Lgr5蛋白是肠道干细胞的标志物，并成功建立了首个肠道干细胞体外3D类器官培养体系，开创了类器官作为疾病模型的研究时代。 目前，类器官在生命科学研究中应用广泛，通过改变不同类器官的基因可以极大地帮助研究生物学过程和疾病建模。然而，由于缺乏简单的基因组工程方法，基因组编辑人类类器官的构建比较困难。 CRISPR/Cas9是进行基因编辑的强大工具，可以对基因进行定点的精确编辑。在向导RNA（guide RNA，gRNA）和Cas9蛋白的参与下，待编辑的细胞基因组DNA可被看作病毒或外源DNA，得到精确编辑。 在2020年3月份，HansClevers研究团队在《Nature Cell Biology》杂志上发表学术论文《Fast and efficient generation of knock-in human organoids using homology-independent CRISPR–Cas9 precision genome editing》。 其利用非同源依赖的CRISPR-Cas9技术，可快速高效地对人源类器官进行基因敲入，他们将该技术命名为CRISPR–HOT(CRISPR-Cas9-mediated homology-independent organoid transgenesis)，为人源类器官的内源基因敲入提供了重要的工具平台。 研究人员利用这种新方法分析了肝细胞如何分裂以及DNA过多异常肝细胞是如何出现的，并发现敲除癌症基因TP53，异常肝细胞的非结构化分裂会更频繁。以上发现或有助于深入研究相关癌症的发展过程。 研究者们为了印证CRISPR–HOT技术在人源类器官中进行基因敲入的方法可行，首先在两种难以转染的人源类器官（肝脏导管类器官及肝细胞类器官）进行测试，并对两种不同介导方式的基因敲入技术产生的类器官进行对比分析。 图示： HDR与NHEJ的技术路线以及优劣比较 结果发现，虽然抑制TP53的活性之后，HDR介导的基因敲入方式的效率略有提高，但仍然比NHEJ介导的基因编辑效率要低。Hans Clevers研究组的工作用CRISPR-HOT方法，建立了不依赖于对TP53活性抑制的以NHEJ介导的基因编辑技术，简化了基因敲入的流程，对于肝细胞等成体干细胞来源的类器官可视化研究提供了可靠的基因编辑方式。 2020年11月，Hans Clevers研究团队又在《Nature Protocols》杂志发表学术论文《Establishment of human fetal hepatocyte organoids and CRISPR–Cas9-based gene knockin and knockout in organoid cultures from human liver》，阐述利用CRISPR/Cas9基因编辑技术探究人类胎儿肝细胞作为类器官长期扩增的培养条件。 在文章中，作者提出：针对人类胎儿肝细胞和人类肝导管类器官的基因组编辑需要两种不同的实验程序。对于人类胎儿肝细胞类器官，采用基于电转杯电转染的转染策略。为此，类器官必须分解成单细胞或小块细胞，建议从第5代及以后开始对肝细胞类器官进行基因组工程设计，肝细胞类器官电穿孔的能力通常不会随时间而降低，作者已经成功地对人胎儿肝细胞类器官进行了基因组工程，可以做到至少第50代为止。 图示：人类胎儿肝细胞类器官的基因组 工程技术概略图 (采用电转杯电转染) 相反，对于人肝导管类器官，转染步骤是对完整的类器官进行的，是一种离体组织电转染的方式。 图示：人类肝脏导管类器官的基因组工程技术概略图 (采用离体组织电转染) 另外针对不同的基因编辑方式（Knock in和Knock out），作者也分享了非常详细的应对策略（见下图）。 俗话说，工欲善其事，必先利其器。那么在Hans Clevers研究团队深耕的类器官领域中，属于他们的一把利器是什么呢？我们发现，在大牛们的研究过程当中，对细胞的转染操作贯穿其中。而NEPA GENE的 NEPA21基因高效转染系统 正是他们所选用的高效电转仪。 NEPA21 基本介绍 【1】采用全新设计的电转程序，电压衰减（Voltage Decay）模式；基因导入+反向导入模式。 【2】不需要特殊转染试剂辅助，节省实验成本；电转程序中的各项参数实时可见、可调，特别适用于优化原代细胞、非常见细胞的电转参数。 NEPA21高效基因转染系统独有的电压衰减（Voltage Decay）设计，可在获得高转染效率的同时，提高细胞存活率。专门针对难转染的原代免疫细胞、干细胞、神经细胞、活体动物、受精卵以及宫内胚胎等转染。 得益于NEPA21良好的应用体验，Hans Clevers利用其已在类器官领域取得了丰硕的研究成果。目前已有多篇应用文献，是Crispr/Cas9基因编辑的第一品牌电转系统。NEPE21——让细胞转染更简单、更Free。

1.什么是基因剪刀呢？

研究发现，细菌有一种能力极强的免疫系统：当外来的病毒（噬菌体）感染细菌时，细菌就利用身体里的一种酶（Cas9）来切断外来病毒（噬菌体）的基因。这样，外来的病毒（噬菌体）不能在细菌身体里复制了（繁殖了），就相当于把病毒（噬菌体）间接杀死了，这样细菌就不会得病了。

根据这种现象，32岁的中国留美博士张锋（在美国麻省理工学院）发明了一种叫作CRISPR/Cas9的技术，也叫基因编辑技术，这种技术能对基因进行剪切，形成了一套基因编辑系统，或许将来人们治病可以选择“基因手术”。

我们知道，人生病大多是由于基因的关系。例如，人患癌症，大多是由于基因突变。如果用CRISPR/Cas9技术将机体里发生突变的基因剪切掉，植入健康的基因，人的癌症就会从根本上治愈。

2.基因编辑研究引起“科研潮”

CRISPR/Cas9技术研究成功以后，世界各国几千个有关实验室都纷纷利用CRISPR/Cas9技术广泛地开展着方方面面的研究，掀起了一股基因编辑研究热潮。

例如，中国科学院昆明动物研究所的研究人员，利用基因编辑技术对两个品种的猴子进行基因改造（学术用语叫基因修饰）。经过基因修饰的猴子繁殖的后代，获得了两个基因靶向修饰的小猴子。这一研究工作引起了国外同行专家的特别关注，研究论文发表在美国《细胞》杂志上。

中国科学院遗传发育所的研究人员用该技术对水稻和小麦基因进行修饰改造，从事育种研究，获得成功。这一研究工作首次证实了CRISPR/Cas9技术能够用于植物的基因编辑。研究论文刊登在美国《自然生物技术》杂志上。

中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所的科研人员，用基因编辑技术治愈小白鼠的白内障遗传病。这一研究成果为疾病治疗开辟了新径。研究论文发表在美国《细胞·干细胞》杂志上。

3.艾滋病也能被根治吗？

美国坦普尔大学神经科学研究院主任卡迈勒·哈利利教授和他的同事利用基因编辑技术，首次成功地从人类细胞中彻底清除了潜在的艾滋病病毒（HIV-1病毒）。该项研究成果发表在美国《国家科学院院刊》上。研究人员认为，这是朝着永久治愈艾滋病的方向迈出的重要一步。专家表示：“这是一项令人兴奋的发现，不过现在还没有准备进行临床试验，它只是证明了我们正朝着正确的方向前进。”

哈利利教授说，因为艾滋病病毒（HIV-1病毒）永远不会从人体的免疫系统消灭，只有用基因编辑技术彻底剪切病毒基因，才能根治艾滋病。

4.修饰人体免疫细胞

据最新消息，美国加州大学旧金山分校的研究人员，已成功利用CRISPR/Cas9技术修饰了人体T细胞。

T细胞是免疫细胞，改造能使其升级更具杀伤力。如艾滋病病毒感染人体时，就是利用其表面的CXCR4蛋白来感染T细胞，使其丧失了杀伤力。修饰T细胞使其表面的CXCR4蛋白失去活性后，艾滋病病毒就不能感染T细胞了。

在癌症免疫疗法中，此基因编辑技术能成功关闭PD-1蛋白分子，进而诱导T细胞攻击肿瘤。该技术修饰改造T细胞，对治疗人体自身免疫疾病、癌症、艾滋病等都是一个新的思路。科学家非常看好此技术，T细胞在血液中循环，能到达很多病灶，也方便从患者体内采集，经编辑后再回输到患者体内，能更有针对性地治疗（此成果见美国《国家科学院院刊》2015年7月刊）。

这种CRISPR/Cas9基因剪刀技术，是一种简便、价廉、多功能、高效率的新技术，它也因此被誉为“基因组编辑的魔术手术刀”。

（本文出自《知识就是力量》杂志2015年9月刊《基因剪刀——基因组编辑的魔术手术刀》，作者：张树庸）

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CRISPR/Cas系统是细菌和古菌特有的一种天然防御系统，用于抵抗病毒或外源性质粒的侵害。当外源基因入侵时，该防御系统的 CRISPR 序列会表达与入侵基因组序列相识别的 RNA，然后 CRISPR 相关酶(Cas)在序列识别处切割外源基因组DNA，从而达到防御目的。

根据Cas蛋白的特点，可将CRISPR/Cas系统分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。Ⅰ型和Ⅲ型系统需要借助复杂的蛋白复合体发挥作用，Ⅱ型系统仅借助 Cas9蛋白和sgRNA即可对靶目标进行编辑，结构简单，操作容易，因此目前主要使用Ⅱ型CRISPR/Cas9 系统。

CRISPR/Cas自诞生以来，迅速发展，已经成为生命科学领域最耀眼、最有前景的技术。尤其是近两年，在全世界科学家的共同努力下，CRISPR/Cas相关新进展新突破不断涌现。

一、基因编辑技术的发展史

基因编辑可以分为三代，第一代：ZFN；第二代：TELEN；第三代：CRISPR/Cas。这三个基因编辑技术都利用了DNA修复机制，所以我们先来了解一下DNA修复机制（ 图1 ）。[图片上传失败...(image-8dab49-1625385468208)]

图1-NHEJ修复（左），HDR修复（右）

NHEJ（Non-homologous end joining）

非同源性末端接合

NHEJ修复机制不需要任何模版，修复蛋白直接将双股裂断的DNA末端彼此拉近，在DNA连接酶的帮助下重新接合（ 图1 ）。

HDR（Homology directed repair）

同源重组修复

当细胞核内存在与损伤DNA同源的DNA片段时，HDR才能发生。

NHEJ的机制简单又不依靠模版，因而NHEJ的活性相对于HDR高出许多。但NHEJ修复出错的概率较高，容易造成移码突变等，基因编辑正是利用了这一点（ 图1 ）。

1.ZFN的识别切割机制

融合锌指模块和FokI切割结构域形成ZFN ；以二聚体的形式靶向切割每个锌指结构；特异识别3个碱基 ；组装多个锌指结构(识别12-18bp)形成的ZFN对可特异切割基因组靶点 （ 图2 ）。

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图2-ZFN基因编辑原理图

2.TALEN的识别切割机制

两个TALE靶向识别靶点两侧的序列；每个TALE融合一个FokI内切酶结构域；FokI通过TALE靶向形成二聚体切割靶点；设计灵活识别特异性强（ 图3 ）。

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图3-TELEN基因编辑原理图

3.CRISPR/Cas9的识别切割机制

crRNA通过碱基配对与 tracrRNA结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA（ 图4 ）。

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图4-CRISPR/Cas9基因编辑原理图

ZFN、TELEN、CRISPR/Cas9比较

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图5-三种基因编辑的比较

二、CRISPR/Cas技术的介绍

CRISPR/Cas9 系统的发现

1987年，在大肠杆菌的基因组中首次发现了一个特殊的重复间隔序列——CRISPR序列，随后，在其他细菌和古菌中也发现了这一特殊序列。

2005年，发现这些CRISPR序列和噬菌体的基因序列匹配度很高，说明CRISPR 可能参与了微生物的免疫防御。

2011年，CRISPR/Cas系统的分子机制被揭示：当病毒首次入侵时，细菌会将外源基因的一段序列整合到自身的CRISPR的间隔区；病毒二次入侵时，CRISPR 转录生成 前体crRNA (pre-crRNA)， pre-crRNA 经过加工形成含有与外源基因匹配序列的crRNA，该crRNA与病毒基因组的同源序列识别后，介导 Cas 蛋白结合并切割，从而保护自身免受入侵。

2013年，发现CRISPR/Cas9系统可高效地编辑基因组。随后张锋等使用CRISPR系统成功的在人类细胞和小鼠细胞中实现了基因编辑。

从此开始，CRISPR/Cas9技术给生命科学领域带来了巨大冲击，CRISPR/Cas9相关研究成果频频登上CNS等顶级期刊，近两年更是成为诺贝尔奖热门候选。

CRISPR/Cas技术的原理

CRISPR/Cas9系统的工作原理是 crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通过碱基配对与 tracrRNA（trans-activating RNA ）结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。而通过人工设计 crRNA 和 tracrRNA 这两种 RNA，改造成具有引导作用的sgRNA （single guide RNA ），从而引导 Cas9 对 DNA 的定点切割（图4）。

CRISPR/Cas技术的优势

设计简单，简明的碱基互补设计原则，识别不受基因组甲基化影响，能靶向几乎任意细胞任意序列，方便同时靶向多个靶点，切割效率高。

三、CRISPR/Cas的脱靶效应

PAM**** (Protospacer adjacent motif )

前间区序列邻近基序

PAM序列区是CRISPR/Cas9系统行使切割功能的基本条件。如果靶序列 3′端没有PAM序列，即使靶序列与sgRNA序列完全匹配，Cas9蛋白也不会切割该序列位点。 PAM序列主要影响CRISPR/Cas9的DNA切割效率。在细胞水平上，NGG介导的切割效率是最高的。

sgR****NA ****(Single guide RNA )

向导 RNA

sgRNA与目标基因组相结合的 20nt 序列区决定着 CRISPR/Cas 系统的靶向特异性。CRISPR/Cas9与靶位点识别的特异性其实主要依赖于sgRNA与靠近PAM区的10~12 bp的碱基配对，而其余远离PAM序列 8~10 bp 碱基的错配对靶位点识别的影响并不明显。目前研究结果均提示，可能靠近 PAM 的 8~14 bp 序列是决定特异性的关键，其他序列也均在不同程度上影响脱靶效应。

CRISPR/Cas9的脱靶效应给研究带来了一定程度上的不确定性，也是限制其发挥更大潜力的主要原因之一。

2017年5月30日， Nature 杂志子刊 Nature Methods 刊登了美国哥伦比亚大学研究人员的一篇文章，研究人员通过CRISPR/Cas9成功修复了导致小鼠失明的基因后，对小鼠进行全基因测序，发现修复后的小鼠基因组有超过1500个单核苷酸突变，以及超过100个位点发生大片段插入或缺失（ 图6 ）。文章的结论无疑引发了巨大震动，也给正在进行中的CRISPR/Cas9带来了不确定性。

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图6--动物体内实验中CRISPR/Cas9编辑后发生意想不到的突变

仔细分析后，发现该文章并不十分严谨，文章仅有两只小鼠作为实验组，一只作为对照组，数量不足以证明结论是否只是个例。而且单碱基突变是生物体内自然现象，不能全归于CRISPR/Cas9。整个实验只基于一个sgRNA数据，且该sgRNA特异性评分很低，造成脱靶效应也应该在预料之中（ 图7 ）。

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图7--针对 Nature Methods 文章的回应

经过一系列的研究和改进，目前CRISPR系统的脱靶性已经很低，当然，要想达到理想的状态，还有很长的路要走。

四、CRISPR/Cas技术的进展

2016年6月，张锋在 Science 发表文章，发现CRISPR/Cas13a能有切割细菌的特定RNA序列。

2016年9月，Jennifer Doudna在 Nature 发表文章，证实CRISPR/Cas13a可以用于RNA检测。

2017年2月22日，美国纪念斯隆.凯特林癌症中心（MSK）研究人员在 Nature 杂志发文，使用腺相关病毒（AAV）介导，将CRISPR/Cas9基因编辑技术应用于CAR-T疗法。该研究既解决了传统CAR-T疗法的随机整合可能存在的潜在危害，又大大降低了CAR-T细胞发生分化或癌化的风险，赋予了CAR-T技术全新的高效性、稳定性、安全性。

2017年8月2日，Shoukhrat Mitalipov在 Nature 发表长文，使用CRISPR/Cas9技术修正了植入子宫前的人类胚胎中一种和遗传性心脏病有关的变异。该研究证实了通过编辑人类胚胎进行治疗遗传病是安全可行的。值得一提的是，该成果受到了基因编辑领域大牛George Church等人的质疑。

2017年8月11日，杨璐菡等在 Science 发表文章，通过CRISPR/Cas9技术敲除猪基因组中的内源逆转录病毒（PERV）序列，并克隆出多只PERV失活小猪。向最终实现使用猪器官进行人体器官移植的终极目标迈进了一大步。

2017年9月，杂交水稻之父”袁隆平院士宣布使用CRISPR/Cas9技术敲除与镉吸收和积累相关基因的水稻育种成功。该研究从根本上解决了水稻镉污染的问题，将扭转我国部分农作物重金属超标的问题，进而改善部分人群重金属慢性中毒的问题。

2017年10月4日，张锋在 Nature 发表论文证实CRISPR/Cas13a能够在哺乳动物细胞中编辑特定的RNA。CRISPR/Cas13a能够达到RNAi相似的降低基因表达的效率，而且有更强的特异性，且对细胞内天然的转录后调控网络的影响更小。

2017年10月19日，Jennifer Doudna在 Nature 发表文章，设计了高精确性的Cas9变体—HypaCas9。该研究极大地降低了Cas9的脱靶效应，且不降低靶向切割效率。

2017年10月25日，张锋在 Science 发表文章介绍CRISPR新系统--REPAIR，可以高效的进行RNA的单碱基修复。因为不改变DNA序列，所以为通过基因编辑治疗遗传病而又不永久影响基因组提供了新可能。

2017年10月25日，哈佛大学Broad研究所的David Liu实验室在 Nature 发表长文，报道了新型腺嘌呤基因编辑器——ecTadA-dCas9，可以将A·T碱基对转换成G·C碱基对，该技术首次实现了不依赖DNA断裂即可进行基因编辑的技术，即单碱基基因编辑技术。该技术高于其它基因组编辑方法的效率，且几乎没有随机插入、删除或其它突变等不良副作用，因此为今后大范围治疗点突变遗传疾病提供了极大的便利。

五****、展望

近几年CRISPR/Cas基因编辑技术飞速发展，推广应用到了生物、医学、农业以及环境等多个领域，造就了一批批科研奇迹，尤其是在遗传病的治疗、疾病相关基因的筛查与检测、肿瘤治疗以及动植物的改造、病原微生物防治等领域有着巨大的潜力，也将深远地影响整个世界。

特别感谢：BioArt主编给予的帮助和意见以及吉满生物吴晨提供图1-图5的图片。

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cas9文库发表的论文

CRISPR （Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats）是细菌用来抵御病毒侵袭/躲避哺乳动物免疫反应的基因系统。科学家们利用RNA引导Cas9核酸酶可在多种细胞（包括iPS）的特定的基因组位点上进行切割，修饰。 Rudolf Jaenisch 研究组将Cas9与Te1和Tet2特异的sgRNA共注射到小鼠的受精卵中，成功得到双基因敲除的纯合子小鼠，效率高达80%。 他们将Cas9/sgRNA 与带突变序列的引物共注射，能准确在小鼠两个基因引入所要的点突变。在ES细胞中他们更是成功的一次敲除了五个基因。与ZFN/TALEN相比，CRISPR/Cas更易于操作，效率更高，更容易得到纯合子突变体，而且可以在不同的位点同时引入多个突变。但该系统是否有脱靶效应尚需进一步的研究。 传统的转基因和基因打靶技术，由于技术稳定成熟，可以对小鼠和大鼠的基因组序列进行各种修饰，仍将是模式动物的构建的主要技术。 核酸酶ZFN/TALEN 尤其是CRISPR/Cas技术如果能解决脱靶效应的话，有可能会广泛应用于小鼠，大鼠及其他模式动物的制备和研究中，成为传统的转基因和基因打靶技术的重要补充。

1.什么是基因剪刀呢？

研究发现，细菌有一种能力极强的免疫系统：当外来的病毒（噬菌体）感染细菌时，细菌就利用身体里的一种酶（Cas9）来切断外来病毒（噬菌体）的基因。这样，外来的病毒（噬菌体）不能在细菌身体里复制了（繁殖了），就相当于把病毒（噬菌体）间接杀死了，这样细菌就不会得病了。

根据这种现象，32岁的中国留美博士张锋（在美国麻省理工学院）发明了一种叫作CRISPR/Cas9的技术，也叫基因编辑技术，这种技术能对基因进行剪切，形成了一套基因编辑系统，或许将来人们治病可以选择“基因手术”。

我们知道，人生病大多是由于基因的关系。例如，人患癌症，大多是由于基因突变。如果用CRISPR/Cas9技术将机体里发生突变的基因剪切掉，植入健康的基因，人的癌症就会从根本上治愈。

2.基因编辑研究引起“科研潮”

CRISPR/Cas9技术研究成功以后，世界各国几千个有关实验室都纷纷利用CRISPR/Cas9技术广泛地开展着方方面面的研究，掀起了一股基因编辑研究热潮。

例如，中国科学院昆明动物研究所的研究人员，利用基因编辑技术对两个品种的猴子进行基因改造（学术用语叫基因修饰）。经过基因修饰的猴子繁殖的后代，获得了两个基因靶向修饰的小猴子。这一研究工作引起了国外同行专家的特别关注，研究论文发表在美国《细胞》杂志上。

中国科学院遗传发育所的研究人员用该技术对水稻和小麦基因进行修饰改造，从事育种研究，获得成功。这一研究工作首次证实了CRISPR/Cas9技术能够用于植物的基因编辑。研究论文刊登在美国《自然生物技术》杂志上。

中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所的科研人员，用基因编辑技术治愈小白鼠的白内障遗传病。这一研究成果为疾病治疗开辟了新径。研究论文发表在美国《细胞·干细胞》杂志上。

3.艾滋病也能被根治吗？

美国坦普尔大学神经科学研究院主任卡迈勒·哈利利教授和他的同事利用基因编辑技术，首次成功地从人类细胞中彻底清除了潜在的艾滋病病毒（HIV-1病毒）。该项研究成果发表在美国《国家科学院院刊》上。研究人员认为，这是朝着永久治愈艾滋病的方向迈出的重要一步。专家表示：“这是一项令人兴奋的发现，不过现在还没有准备进行临床试验，它只是证明了我们正朝着正确的方向前进。”

哈利利教授说，因为艾滋病病毒（HIV-1病毒）永远不会从人体的免疫系统消灭，只有用基因编辑技术彻底剪切病毒基因，才能根治艾滋病。

4.修饰人体免疫细胞

据最新消息，美国加州大学旧金山分校的研究人员，已成功利用CRISPR/Cas9技术修饰了人体T细胞。

T细胞是免疫细胞，改造能使其升级更具杀伤力。如艾滋病病毒感染人体时，就是利用其表面的CXCR4蛋白来感染T细胞，使其丧失了杀伤力。修饰T细胞使其表面的CXCR4蛋白失去活性后，艾滋病病毒就不能感染T细胞了。

在癌症免疫疗法中，此基因编辑技术能成功关闭PD-1蛋白分子，进而诱导T细胞攻击肿瘤。该技术修饰改造T细胞，对治疗人体自身免疫疾病、癌症、艾滋病等都是一个新的思路。科学家非常看好此技术，T细胞在血液中循环，能到达很多病灶，也方便从患者体内采集，经编辑后再回输到患者体内，能更有针对性地治疗（此成果见美国《国家科学院院刊》2015年7月刊）。

这种CRISPR/Cas9基因剪刀技术，是一种简便、价廉、多功能、高效率的新技术，它也因此被誉为“基因组编辑的魔术手术刀”。

（本文出自《知识就是力量》杂志2015年9月刊《基因剪刀——基因组编辑的魔术手术刀》，作者：张树庸）

论文发表的稿费是谁给谁

发论文的版面费是学生给。

是研究生自己出钱，因为文科导师很缺钱缺课题经费，如果是学校要求研究生毕业要有一篇发表的论文，则这一篇是导师出钱，原则上导师只支持一篇。

学术性期刊的格式是非常严格的，论文的格式可以参照你所投刊物的要求去做，至于字数，因为很多刊物是按计空格字数收费的，所以，要根据需要确定文章的字数。

即高知名度、高学术水平的期刊，此类期刊约50种左右，建设“中国期刊方阵”的运作步骤采取分级负责的形式。

版面费

版面费是指在国家新闻出版总署批准的正规学术期刊上发表的论文，被刊物录用后，期刊编辑向论文作者收取的费用。版面费是在学术期刊和学术研究兴盛的环境下产生的；从版面费自身形成的构件和程序看，版面费是两方的自觉自愿的合约行为，是两个巴掌拍出的响，无违法违纪可言。

“版面费”早已成为国内学术界公开的秘密，以版面费为核心的论文产业链，已经发展到了相当的规模，究其原因，可以说版面费起到了很大的助推作用。

名字由来

版面费是在我国现有的科研评价机制环境下产生的，它的出场并非偶然。

作者人数特别是高校的研究生和教师人数逐年增加，要求发学术论文的数量随之增加。一般硕士、博士生毕业有需要“在省级以上公开刊物发表学术论文两篇”的硬指标，论文发得不够就拿不到学位。教师评职称也需要在核心期刊上发表一定数量的学术论文。

正是高校师生获得学位、职称的需要，使得他们对学术期刊趋之若鹜 ，付版面费成了在所不惜的自觉行为。

收费，课题负责人出钱。在校期间，大学本科生，硕士研究生，博士生想要发表论文到学术期刊或者其他类型的论文学术网，是需要收费的。产生的费用由撰写论文课题的负责人进行缴纳，缴纳费用可以想学校申请报销。

我们这里是只要是涉及个人晋升职称、晋升职务及不是单位要求的就得自己拿钱。

作者有三个人当然要付给三个人了。应该是三个人平均分配的。因为三个人都是作者，都出过力。即使给其中的某个人，这个人也要分给其他的两个人。因为是他们共同的作品。

谁谁发表过电子竞技的论文

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一、电子竞技体育产业的发展背景 1.电子竞技概念。电子竞技产生于网络游戏,国家体育总局对电子竞技的定义是:电子竞技是利用信息技术为核心的软硬件作为器械进行的、在体育规则下实现的人与人之间的对抗性运动。从定义上看,电子竞技与其他的体育竞技项目并无不同。通过这项运动,可以锻炼和提高参与者的思维能力、反应能力、心眼四肢协调能力和意志力,培养团队精神。电子竞技运动把信息技术和体育竞技紧密联系在一起,是一项受到广大人民群众欢迎的新兴体育项目。 2.电子竞技体育产业产生的背景分析。在国外,电子竞技作为体育概念的延伸正处于蓬勃发展的阶段。电子竞技体育产业在韩国已经成为国家的支柱产业,并被列为韩国三项最大体育竞技之一(足球、围棋、电子竞技),年产值相当于40亿元人民币。据北美最大的娱乐软件商会组织IDSA统计:2001-2004年全球电子竞技产业年均成长率持续高达15%,2003年北美电子竞技产值为100亿美元,到2004年欧美的总产值达到490亿美元。我们认为不是所有的体育竞技都可以成为一项产业,作为一项产业,必须在市场化条件下拥有巨大的供给和需求。具体可从以下几个方面对电子竞技体育产业产生的背景进行分析: (1)中国上网用户剧增。根据CNNIC(中国互联网络信息中心,下同)的调查,截止到2004年6月30日,我国的上网用户总人数为8700万人,同1997年10月第一次调查结果62万上网用户人数相比,增加了140.3倍。我国网民总数的快速增长已为世界所瞩目。但8700万网民在我国将近13亿的总人口中还仅占6.7%,这说明尽管我国的互联网用户总数很大,增长速度较快,发展空间仍非常大。巨大的网民数量意味着巨大的消费群体和消费需求,需求就意味着商机和市场,这也正是电子竞技体育产业诞生的先决条件。 (2)电子竞技体育伴随新技术而产生。电子竞技借助于网络、计算机、鼠标、键盘与统一的规则等实现不同组织和系统间信息的廉价传递,进行人与人的对抗。电子竞技集计算机技术、通信技术、自动控制技术和人工智能技术之大成,这与足球运动员借助草地、球门和足球进行对抗,篮球运动员借助篮球场、篮球和球框进行比赛几乎一样,最大的区别就是电子竞技只有在信息技术足够成熟的情况下才产生。20年前信息技术没有这么发达时,没有人能预料到这个项目的产生。 (3)经济的发展使电子竞技成为一种需要。我国居民恩格尔系数1990年为54.2%, 2002年为37.7%(资料来源:1990、2002《中国统计年鉴》)。这意味着随着我国经济的发展和居民收入的提高,以及闲暇时间的增加和工作压力的增大,人们愿意在休闲娱乐上花销更多。计算机网络由于其互动性、趣味性和便捷性受到人们的青睐。CNNIC2004年7月的调查报告显示,有34.5%的用户把休闲娱乐作为其上网最主要的目的。 3.电子竞技体育产业是产业融合的产物。 经济学家亚当·斯密经过研究发现,工业文明的秘密在于“分工”,分工是财富的根本来源。分工是工业经济与农业经济最初也是最大的区别点。亚当·斯密据此而作的《国富论》成为西方经济学的奠基石和理论依据。但信息技术的发展却预示融合是当代财富的根本来源。融合是信息经济与工业经济最大的区别点。有学者认为,就生产者与消费者、买方与卖方关系而言,农业财富来自他们之间的合一;工业财富来自他们之间的分工;信息财富来自他们之间的融合。 信息产业的知识信息特征使其具有向其他社会产品的附着性、粘贴性和渗透性,从而与其他三类产业相比具有较高的关联度。信息产业的产品一旦被人们需求,就会以极快的速度扩散它的影响,并和其他产业相互交叉、渗透,产生新的产业,称为产业融合。电子竞技体育产业正是信息产业和体育产业融合的产物。 二、电子竞技体育产业发展中存在的问题 1.社会对电子竞技的偏见。当代,电子竞技之所以能成为一个体育竞技项目、一个新兴产业,是和社会的进步、科技的发展以及人民群众精神文化的需要息息相关的。虽然有无数的人在这一高科技的智力运动项目里乐此不疲,但在现实中,社会舆论有意无意地给人们灌输电子竞技有害论。一些媒体大量报道某些学生沉溺于游戏之中不能自拔,荒废青春和学业的事件,使电子竞技成为“人人喊打”的“电子海洛因”。社会舆论的巨大压力使得电子竞技面临严峻的生存压力,企业难以名正言顺地进入这个市场;运动员还只能叫“玩家”,其待遇和一般的运动员根本不可同日而语;广大爱好者只能偷偷摸摸地从事电子竞技;政府面对巨大的舆论压力也难以理直气壮地进行引导和监管,有时不得不以禁代管。电子竞技比赛的电视转播禁令可谓当前社会歧视中国电子竞技产业的典型反映。可以说,社会的偏见是影响电子竞技体育产业正常发展的巨大阻力。 2.政府缺位和错位管理。在2003年中华全国体育总会把电子竞技确定为国家体育总局正式开展的第99个体育项目之前,我国政府一些有关部门对于电子竞技的本质特征认识不清,对该产业的迅猛发展和对其他产业的带动作用估计不足,对电子竞技存在缺位管理和错位管理。一些管理部门往往在没有出现问题时不闻不问,放任自流;另一些管理部门见有利可图时纷纷插手;但出了问题时各管理部门相互推诿,或矫枉过正,干脆“一禁了之”。自从媒体报道了一些青少年沉溺于网络游戏而影响正常生活的事情后,很多地方政府主管部门就视电子竞技为洪水猛兽,对其“严防死守”。我国体育总局计划于2004年举办的首届CEG(China E-sport Game,全国电子竞技运动会)因故延期就与此有关。 3.电子竞技项目国产化程度低下。目前在中国国内受到欢迎的电子竞技项目很多,如球类项目有FIFA足球、NBA篮球,射击类项目有三角洲特种部队、反恐精英,综合对抗类项目有星际争霸等。但这些为中国人耳熟能详的项目却无一例外是国外开发商研发的。据统计,大陆以外地区开发的电子竞技项目占了我国电子竞技80%的市场份额(数据来源:根据相关数据整理)。国产化程度低下的一个重要原因是缺乏电子竞技软件开发人员。从机器智能、图像、音效、色彩、创意、剧情、思想性等各方面看,好的电子竞技作品完全可以和电影等艺术作品相提并论。一个好的电子竞技软件人才不仅要会软件程序设计课程和软件美术设计课程、3D动画设计,还要时刻把握国外软件开发先进的设计理念、技术和市场行情。信息产业部的一项调查显示:全国包括美编在内的电子竞技软件开发技术人员只有不到3000人,而市场需求量是60万人。国内某著名软件研发公司经理称,现在月薪8000元都很难聘请到合适的电子竞技软件开发人员。电子竞技软件人才的匮乏使我国电子竞技软件国产化程度低下,已有的国产软件技术含量也不高,缺乏国际竞争力。国外的产品毕竟不是我们自己的产品。为了拿到代理权,国内代理商竞相出价,费用不菲,尤其是代理一款已经成名的作品更甚。由于没有自主版权,除了国内的运营公司要支付版权费用、代理费用以外,正式投放市场以后还需要与研发公司进行分成。目前,国内代理商在产品销售期间必须支付高达25-35%的利润分成。这样自然就加大了运营的成本与压力。可见,软件代理虽然门槛低、上手快,但很难形成核心竞争力。我国优势体育项目的发展历程说明,没有一项竞技体育是光靠“拿来主义”就可以达到世界先进水平的;从产业经济的发展过程看,我国具有世界竞争力的产业也往往是国产化程度高的产业(如家电、纺织业等)。国产化程度低下使我国电子竞技体育产业的发展先天不足。麻烦采纳，谢谢!

写作思路及要点：以我看电子游戏为题，围绕这一主题展开详细描写，接着表达自己的想法以及观点。

正文：

这是一个最好的时代，也是一个最坏的时代。因为这个时代发展迅速，人们孜孜不倦地创造出一种有一种休闲娱乐方式，于是便有人沉湎于游戏。但电子游戏于我们青少年终究是弊大于利，沉迷游戏，犹如步入万丈深渊，稍有不慎，就会前途尽毁，潦草一生。

青少年尚处于成长期，还未形成稳定的三观，而电子游戏内种种低俗、幼稚、暴力倾向的内容对青少年健康发展和正确价值观的形成存在潜在的威胁。因此，近日国家网信办推出“青少年防沉迷系统”，为青少年营造健康绿色的网络环境。

为了不让青少年过度沉迷网络游戏，各游戏软件也采取了一定措施，如前短时间《王者荣耀》游戏出台的系列防沉迷系统。这不仅体现了行业责任，也说明过度的娱乐会影响到青少年的成长。

反之，如果没有这一系列的措施，无可否认的，沉迷游戏的人会如潮水一般接连不断。电子游戏为人们搭建了一个诱惑力十足的虚拟世界，沉迷其中，慢慢地就与现实脱轨。那些青少年因长期沉迷游戏，患上“网瘾症”“精神分裂症”等精神疾病或误入歧途，实施偷盗伤人等犯罪行为的事件便会层出不穷。

因为电子游戏弊大于利，所以“青少年防沉迷系统”有它存在的合理性，但认识事物还需要通过表面看到背后的本质，沉迷与防沉迷背后的原因是什么呢？调查表明，相对于城市的孩子，农村的留守儿童更容易沉迷网络。

城市孩子在父母的陪伴下有更多的娱乐方式，而留守儿童缺少父母的关爱和监护，当他们通过游戏收获快乐、满足，通过网络得到关注时，就会“上瘾”，其实，沉迷的背后是需求。但是，歌德曾说过：“谁若游戏人生，他就一事无成；谁不能主宰自己，便永远是一个奴隶。”

为了不让青少年被游戏驾驭，防沉迷更应该挖掘青少年沉迷的原由。“青少年防沉迷系统”固然具有合理性，但治标不治本，最有效的还是要培养青少年的自控能力以及给予心灵上的关爱。

身处这样一个充满变数、危机的时代，我们应该静下心来，从多个角度看电子游戏，知道电子游戏的乐趣，但我们更应该看见它对学业、生活、身心健康造成的影响。“光天化日之下的巨大身影，必然会带出同样巨大的阴影。”余秋雨的这句话就警示我们切不可因为表面的光亮，而忽视了潜藏在阴影里的风险。

对电子游戏的沉迷，对虚拟世界的深陷不拔，终究会让我们尝尽其弊端。“青春须早为，岂能长少年。”不如告别电子游戏，走出幻境，在现实之中打下一片壮丽的江山，收获一份真切的情谊，饮一杯苦尽甘来的美酒，倾听一曲真挚的心音。

电子竞技走向体育化随着电竞行业正式归入体育项目，电子竞技产业发展进入新阶段，2016年以来，电子竞技行业政策利好不断，包括：中国文化娱乐行业协会成立电子游戏竞技分会；国家发改委、文化部等发文鼓励发展电子竞技赛事；教育部将电子竞技设为高职正式专业等。电子竞技纳入体育范畴后，电子竞技产业市场空间的不断扩大，对社会释放出更多的正面影响力。围绕“体育化”目标，电子竞技行业在“UP大会”上宣布了“体系化升级”“城市化布局”及“规范化运营”三大策略及具体措施。基于电子竞技体育化发展计划，行业将与所有合作伙伴一起，以赛事为核心、以联盟为依托、以教育为根本、以产业园为载体，打造一个绿色、可持续发展的电子竞技产业。电子竞技走向规范化腾讯公司是我国电子竞技产业发展的领头羊，在《腾讯2018电子竞技运动标准》基础上，腾讯继续完善电竞行业规则，着重搭建赛事规范、硬件规范和技术规范体系，与各地政府部门及官方体育组织一起建立完善的电子竞技运动标准体系，行业监管力度持续提升。未来将针对促进行业规范以及维护市场秩序，出台多项重磅政策。电竞正一步步成为一项被社会认可、具有巨大发展潜力的体育运动。目前，全国已有十多个城市布局电竞场馆。除了通过主办赛事以及赛事直播和门票收入获取收益外，电竞场馆还能通过赛事吸引人流，再通过餐饮、桌游、上网服务的途径实现盈利，同时可以举办音乐会、见面会、发布会等活动获取收益。更重要的是，电竞场馆还有助于提升一个城市的产业层次，也正是如此，不少地方政府以PPP的形式参与到电竞场馆的建造中来。电子竞技走向市场化电子竞技产业市场化发展，带动了一批俱乐部和职业联赛的兴起，很大程度上改变了电子竞技产业在中国的发展轨道。随着资本进入，直播和电竞赛事日益受到关注。其中，电竞赛事更具市场潜力。英雄联盟全球总决赛的收看观众超过1亿，与此同时，活跃的电竞市场也提高了竞争强度。直接拉动消费是电竞作为经济新动能的一个重要表现。一方面，电竞的消费习惯往往表现为游戏内消费，表现为购买游戏皮肤和品牌外设。另一方面，众多电竞用户到现场观赛，购物中心可以选择通过与电竞企业合作举办赛事的方式，将人流导入线下购物场所，开启“集市+电竞”的跨界融合。与此同时，还可以通过线下电竞赛事、直播等形式将线下粉丝客流导流至电商平台。或与电竞明星合作，采用游戏互动、社交互动等方式与电商产品相结合，通过电竞粉丝经济拉动产品销售，实现“电竞+新零售”的无缝衔接。此外，电竞已经成为增加就业的一个新型渠道。一方面，电竞的出现已经完全颠覆游戏是“不务正业”的主流价值观，上升为一个技能化、职业化与专业化的体育运动；另一方面，电竞已经不再是“富二代”的专门游戏，广大草根青年都可以参与进来，使得电竞具有更广泛的参与度。特别是随着电竞俱乐部的市场化运作，不少游戏玩家因此可以由业余转向职业，获得稳定的收入，而且赛手退役后还可以顺利进入电竞培训、游戏开发等行业。但随着用户的不断增多以及产业链的形成与扩张，电竞从业人员获得的报酬必然会越来越高。电子竞技走向全民化近年来，电子竞技的边界范围正在不断扩大，真正触及更多非核心粉丝的大众人群。与此同时，电竞行业的“壁垒”被进一步打破，更多的行业、品牌、资本都纷纷进军电竞，参与行业共建。众多知名企业家组建战队，加快了中国电竞的崛起速度。随着网络直播平台的兴起，电子竞技赛事观看移动化，使得电子竞技被越来越多的人所熟知。国内电竞行业的用户群将不断扩大，迎来全民参与时代。英雄联盟、王者荣耀作为时下最火热的两款游戏，其中国赛区内的两大职业联赛赛事LPL与KPL对于电竞破壁，有着不可推卸的“责任”，它们是破壁的先锋军。它们从传统体育联赛“取经”，率先进行了联盟化、地域化等诸多改革。尤其是地域化的改革，通过把LPL和KPL主场落户于重庆、杭州、西安等城市，为这些城市培育了电竞土壤，让电竞战队犹如洒落在土壤里的种子，从小到大、从无到有，催生出了粉丝、场馆、个性化周边等电竞生态体系，举办更多全民性、大众化的落地竞技比赛。这是一条完整的电竞赛事生态链不可或缺的部分，也是中国电竞走向体育的必经之路。电子竞技走向国际化随着全球电子竞技产业的快速发展，电子竞技运动也开始受到越来越多的关注，包括耐克在内的众多国际著名体育品牌与电子竞技正碰撞出新的火花。与耐克的合作，能够更加提升电竞运动的市场价值；与耐克合作，能够为电竞运动员带来更加专业化和科学化的服务，也让电竞运动以更多元更深入的方式融入大众生活。腾竞体育正和耐克共同努力，融合彼此的专业性与创造力，为我们的电竞运动员以及电竞爱好者创造更加多元化的内容和服务，以此塑造一种全新的生活方式，并传递更加积极向上的体育精神。作为全球年轻人的共同爱好，电子竞技正成为全世界文化交流的桥梁。近年来，在世界电竞发展过程中，中国扮演了不可或缺的角色，很多外国人正是通过电竞更好地认识中国的年轻人，更深入地了解中国。得益于各级政府的大力扶持，以及如火如荼的国内外赛事，一批优秀的电竞选手、职业战队纷纷涌现，电竞内容制作的产业链得到完善，电子竞技产业正向着国际化方向发展。

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如果从知识产权上来说，研究成果算是通讯作者的通讯作者享有全文知识产权，第一作者享有自己制作部分知识产权。因为，通讯作者一般指整个课题的负责人，承担课题的经费，设计，文章的书写等。他也是文章和研究材料的联系人。最重要的是，他担负着文章可靠性的责任。第一作者一般是本文工作中贡献最大的研究人员。此作者不仅有最多和最重要的图表(即体力上的贡献)，也是文章初稿的撰写人(即对本文的智力贡献)。