快速检测阿尔茨海默标志蛋白(Tau)的阻抗生物传感器研究
阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)是一种常见的神经退行性疾病,其重要特征为认知和记忆能力下降,表现为认知障碍、视觉空间认知、语言和日常生活能力的丧失[1]。阿尔茨海默病的发病率与年龄呈正相关,约每5年增加1倍,随着我国人口老龄化日趋严重,AD将对日常生活及社会带来巨大影响[2]。目前国际上主要使用NINCDS ADRDA方法来确诊AD,即通过临床检查和神经测试排除其他疾病引起的痴呆,该方法的准确率较高,但是确诊时通常为AD晚期[3]。如果能早期实时监测这种状态的诊断性标记物,将有益于阿尔茨海默病患者的治疗。
国内外大量文献表明,Tau蛋白以及Tau蛋白与其他因子的相互作用对阿尔茨海默病患者的神经变性和学习障碍具有重要影响[4]。Tau蛋白是一种亲水、可溶、非折叠的微管相关蛋白(Microtuble associated protein,MAP),能够维持细胞内神经元生长,并维持神经元极性及物质转运功能等[5]。Tau蛋白稳定地存在于神经元细胞中,但当其从微管上解离并形成神经元纤维缠结(Neurofibrillary tangles,NFTS)和成对螺旋丝(Paired helical filaments,PHF)时,该蛋白将触发神经性疾病如阿尔茨海默氏病。Tau蛋白病理学与Tau不溶性丝的存在相关联,不溶性Tau聚集的形态学研究已有报道,但Tau蛋白聚集对阿兹海默症发病初期的影响仍处于探索阶段。Tau蛋白通常在后期(以不溶性聚集物为主),通过光学光谱(硫磺素T荧光和圆二色性)和显微镜(透射电子显微镜)检测被发现。由于Tau蛋白不溶性聚合物存在无序折叠,Tau蛋白构象变化的早期聚集过程始终无法探明[6]。但若能在Tau蛋白早期聚集时即检测到其在脑脊液中的含量变化,仍然对AD确诊具有重要辅助作用。
近年来,随着电化学传感器的发展,关于蛋白质的电化学研究已渐渐深入,其中电化学阻抗谱(EIS)对蛋白质的构象变化和蛋白结合非常敏感,只需要小的样品体积,就能很容易扩展到生物测定平台进行生物标志物和抑制剂的筛选。EIS实验具有无创性,在检测过程中不扰乱蛋白质构象[7],已广泛应用于检测蛋白质-蛋白质和蛋白质-DNA的相互作用,和对单层自组装及其表面上蛋白质的吸附特性研究。李艳霞等[8]自制了分子印迹传感器,通过先在玻碳电极表面修饰一层纳米金,然后自组装L-半胱氨酸,成功制备了以牛血红蛋白为模板的印迹聚合物层。用该传感器测得牛血清蛋白的线性范围为1.0~1.3×103 mg/L,检出限为0.5 mg/L。Suprun等[9]设计了一种新的基于商用炭黑(CB)N220和双十二烷基溴化铵(DDAB)的丝网印刷电极传感器,该传感器可检测到血红蛋白和Fe的直接电子转移反应。该传感器上有形状规整的矩阵,可通过修饰不同的识别单元如细胞色素c(cyt c)、肌红蛋白(Mb)、辣根过氧化物酶(合)和细胞色素P450(CYP 51 a1,CYP 3 a4,CYP 2 b4)拥有不同性能,如CB修饰的传感器(CB/DDAB-modified免疫传感器)成功检测了血红蛋白。该传感器可用于血浆样本有显著差异的患者的检测,用于辅助判定心肌梗塞程度。Esteves-Villanueva等[7]最早使用电化学阻抗谱法检测Tau蛋白,研究发现Tau-Au电荷转移电阻(Rct)为(2.9±0.6) kΩ。随着Tau蛋白结合到Tau-Au表面,基于Tau-Tau-Au形成的界面Rct下降为(0.3±0.1) kΩ (90% ±3% ),但其线性范围仅为0.2~1.0 μmol/L,达不到医学上对Tau蛋白检测的要求。
本研究构建了一种基于自组装膜的电化学传感器,将3,3′-二硫代双(磺酸琥珀酰亚氨基丙酸酯)(DTSSP)结合到金电极表面,并通过酰胺键固定抗体,使用免疫方法捕获Tau蛋白并检测。通过电化学阻抗谱检测电极表面特异性蛋白的吸附。该传感器构建步骤简单,且无需标记,具有检出限低、特异性好、检测时间短的优点。
当分k类时,找 ik分割点使得上式(8)的值最小,即 F(n,k)=F(ik-1,k-1)+D(ik,n)从而求出第k 类。然后再求 ik-1分割点,使 F(ik-1,k-1)=F(ik-1-1,k-2)+D(ik-1,n),以此类推得出所有分割点求出最优解。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
将Tau441蛋白以PBS稀释成100、20、5、2、0.2、0.02 μg/mL,将稀释后的Tau441蛋白溶液滴加在传感器表面孵育1 h(滴加液体体积为10 μL,确保液体完全覆盖金表面)。孵育结束后,用20 mL PBS浸没洗涤,除去未结合的蛋白,并用循环伏安及电化学阻抗进行表征。
1.2 传感器构建
Email:cefs@vip.163.com(有意参加者,请先发邮件索要报名表)。投稿和演讲日程等学术事宜,请联系臧建成大夫(电话)13261797099
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图1 电化学阻抗测量(EIS)的等效电路图 Fig.1 Equivalent circuit diagram of electrochemical impedance measurement (EIS) Cdl represents the double layer capacitance(双层电容),Rct is the electron transfer impedance(电子传递阻抗),Zw is the Warburg impedance(Warburg 阻抗) and Rs is the electrolyt’s resistance(表征液阻抗)
EIS及CV检测均使用三电极系统,其中2 mm金盘电极为工作电极,饱和甘汞电极为参比电极,铂片电极为对电极。电化学检测使用ZAHNER电化学工作站自带的THALES软件包,分别进行循环伏安法(CV)及交流阻抗法(EIS)检测。其中,交流阻抗法检测范围为0.1 Hz~100 kHz,扰动电压为10 mV,在开路状态下检测。记录反应过程的Nyquist图(Z″及Rct,其中Rct为电子传递阻抗,Z″为阻抗虚部),并通过构建等效电路(图1)进行拟合。通过ZAHNER电化学工作站自带的THALES软件模拟阻抗检测的信号变化机制。以Tau蛋白被捕获前后电子传递阻抗的变化值作为抗体和抗原之间的免疫信号,用ΔRct表示。循环伏安法电位为-0.2~0.6 V,扫描速率为100 mV/s,将循环伏安检测作为辅助手段,判断峰电流变化趋势是否与EIS阻抗大小变化一致。检测使用的表征液均为1 mmol/L [Fe(CN6)]3-/4-(1∶1)-PBS,体积为20 mL。
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图2 生物传感器示意图(A)与DTSSP分子式(B) Fig.2 Schematic illustration of biosensor(A) and DTSSP formula(B)
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图3 DTSSP修饰不同时间的CV曲线 Fig.3 CV curve of DTSSP modified different hours the characterization solution was 1 mmol/L[Fe(CN6)]3- / 4- (1∶1)-PBS solution;scanning speed is 100 mV/s;potential range is -0.2-0.6 V
实验过程中,对DTSSP修饰时间及抗体浓度进行优化,以优化后的传感器通过免疫反应捕获特异性目标Tau441蛋白。
1.3 电化学检测
传感器按以下步骤构建:①将打磨好的金电极用水冲洗,然后浸入1 mg/mL DTSSP溶液,室温过夜,通过巯基-金化学键将DTSSP修饰到金电极表面。②使用水冲洗并烘干电极表面后,滴加10 μL 0.05 mg/mL 抗体,确保金电极表面被溶液完全覆盖,室温孵育1 h,通过烷磺基-氨基结合抗体。③将电极浸没于10 mmol/L磷酸盐缓冲液中1 min,洗去非特异性吸附。④为减少非特异性信号,滴加10 μL 0.1 mol/L乙醇胺(ETA)溶液封闭1 h,待传感器表面所有未反应的活性酯基封闭后,将电极浸没于10 mL水中洗涤1 min,然后对Tau蛋白进行捕获。
2 结果与讨论
随着结合时间的增加,巯基化合物在金电极表面的组合厚度逐渐达到极值。巯基化合物结合到金表面首先是吸附过程,由于在1 h内,大多数分子简单吸附到电极表面,金表面电子传递受阻,从而导致电极表面电阻快速升高。修饰时间>12 h(过夜)的电极表面峰电流相较于修饰时间为1、2 h时明显降低(图3)。图4B显示,当修饰时间达到4 h时,电极表面的阻抗值已接近峰值,继续增加孵育时间并不能引起阻抗值的显著增加。结合图3及图4中不同结合时间的CV及EIS图可见,随着修饰时间的递增,峰电流降低,峰电位增加,ΔRct值递增。当修饰时间为4 h时,阻抗值接近饱和,但李占明[10]采用印刷叉指微电极快速检测食品中大肠杆菌和黄曲霉毒素时发现,延长孵育时间有助于单分子层的定向排列,而该层自组装膜的定向规则排列,有利于吸附更多的抗体以及抗体的定向排列。因此,综合考虑选择结合时间为过夜(>12 h)。
结果显示,抗体39E10与ETA结合到传感器表面后,阻抗值随着浓度升高而增加,当抗体质量浓度为0.2 mg/mL时,阻抗值达到最大。考虑到实验成本,进一步对比了抗体捕获相同浓度后引起的阻抗变化(即最终传感器构建完成后的目标信号)并作为抗体浓度的选择依据,结果发现目标信号远大于抗体引起的阻抗变化值,适当地降低抗体浓度并不显著影响其最终捕获Tau蛋白的能力。为保证实验效果,并节省传感器构建成本,实验选择0.05 mg/mL为抗体浓度构建自组装传感器。
2.1 DTSSP结合时间与响应信号的关系
传感器构建过程如图2A所示,DTSSP通过Au-S键定向固定在金电极表面,随后通过烷磺基-氨基结合抗体39E10,经过ETA封闭后,通过免疫反应特异性捕捉抗原Tau441蛋白。
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图4 不同DTSSP修饰时间的负奈奎斯特图(A)与等效电路拟合后的阻抗变化值(B) Fig.4 Negative Nyquist plots(A) and the impedance values(B)with different DTSSP modification times characterization solution: 1 mmol/L[Fe(CN6)]3-/4-(1∶1)-PBS solution;scanning speed: 100 mV/s;potential range:-0.2-0.6 V
2.2 抗体浓度与响应信号的关系
如前文所述,对自组装膜修饰时间进行优化后,通过DTSSP的NHS-酯基结合抗体游离的氨基。抗体于室温下孵育1 h后,用20 mL PBS溶液浸没洗涤1 min,以除去表面未结合的抗体。之后,通过Tau441蛋白与抗体的强吸附作用,将Tau蛋白固定在抗体层上。捕获Tau之前,实验对抗体浓度(0.01、0.05、0.1、0.2 mg/mL)进行了优化。由于蛋白质的三维结构,自组装膜表面存在未结合位点,为减少非特异性信号对目标信号的干扰,使用0.1 mol/L的ETA封闭未结合位点,室温结合1 h,用水冲洗后进行CV及EIS检测,并比较抗体结合前后的阻抗变化值。
4.毛笔书法作品的可复制性。复制权是著作权的一项核心的权利。而且这种权利也是随着人类社会的不断发展而不断得到加强的。毛笔书法作品属于美术作品的一种,而美术作品的使用具有其特殊性。它的使用要求必须是原作,否则就不可能发挥它的艺术的价值。但是,这并不能否定毛笔书法作品的可复制性。相反,却是从反面证明了毛笔书法作品的可复制性。因为正是它的可复制性,才会有赝品的出现。特别是对于那些艺术价值极高的作品,比如王羲之的《兰亭集序》、颜真卿的《祭侄稿文》等。
通过以上步骤构建特异性传感器后,采用循环伏安法及电化学阻抗法表征检测结果。如图5A、B所示,随着实验过程的推进,CV峰电流变化与阻抗值的变化趋势一致。首先,金表面结合DTSSP后引起峰电流减小,阻抗增加,说明金表面电子传递受阻,氧化还原反应不可逆性增大,这是由于金表面附着了难导电的物质DTSSP。随后,在金表面自组装成膜后,抗体通过共价键结合到电极表面,引起峰电流增大,阻抗减小,这一结果与Wang等[11]加入抗体39E10到其自组装传感器的变化一致。阻抗值的降低证实39E10与DTSSP的结合增大了自组装膜的导电性,这是由于39E10为带正电荷的蛋白质,通过化学键与DTSSP结合后,为探针引入正电荷,导致传感器表面电子转移电阻降低。
传感器构建前,使用Pirannha溶液(30% H2O2-浓H2SO4)处理金电极表面3 min,之后分别经0.3、0.05 mm铝粉打磨,并于水中超声处理5 min,每一步均使用水冲洗。将传感器在1 mmol/L [Fe(CN6)]3-/4-(1∶1)-PBS溶液中进行表征,经过循环伏安法(CV)及交流阻抗法(EIS)检测,确保循环伏安峰电位差ΔEp<75 mV,阻抗低于200 Ω。
2.3 Tau441蛋白检测
ZAHNER电化学工作站(德国),提纯Tau蛋白抗体(39E10,结合位点189~195,Biolegend(Covance)),人全长Tau蛋白Tau441(艾博抗(上海)贸易有限公司),3,3′-二硫代双(磺酸琥珀酰亚氨基丙酸酯)( DTSSP,Sigma(上海)贸易有限公司),铁氰化钾(K3[Fe(CN)6]),亚铁氰化钾(K4[Fe(CN)6]),磷酸盐缓冲液(PBS,0.01 mol/L,pH=7.2)由氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠配制(国药集团化学试剂有限公司)。实验用水为 Milli-Q系统生产的超纯水(18.2 MΩ·cm)。
没错,是绝望。从那种颤抖中,青辰没有感受出恐惧或者焦虑或者其他的一些情绪,只感受出了绝望,一种深深的绝望。
结果表明,在0.02~100 μg/mL Tau441蛋白质量浓度范围内,随着浓度的增加,抗体捕获更多抗原,电极表面的修饰层结构更加紧密,进一步阻碍了[Fe(CN)6]3-/4-探针与电极表面的电子交换,导致电极表面阻抗值显著增加;但达到一定浓度后,阻抗值增大的趋势变缓,这是由于抗体浓度固定后,定量的抗体捕获抗原具有阈值。而Tau441蛋白在脑脊液中的含量极低,因此低浓度的信号响应更有意义。数据显示,Tau441蛋白浓度在0.2~20 μg/mL具有线性关系,线性方程为y=3.270 2x+9.975 8,r2=0.988 8,检出限为0.43 nmol/L。
图5 生物传感器逐步修饰过程的CV响应(A)和EIS曲线(B) Fig.5 CV response(A) and EIS curves(B) of the fabrication procedure of biosensor the characterization solution was 1 mmol/L [Fe(CN6)]3-/4-(1∶1)-PBS solution and Rct was the electron transfer resistance in the frequency range of 0.1 Hz-100 kHz
2.4 电极的再生
在保持金电极灵敏性和选择性的条件下,通过Pirannha溶液对金表面进行处理,在同样的实验条件下,进行新一轮的传感器构建,其灵敏度基本不变,证明经过再生处理后,原有的共价键解开,使得金电极可以重复利用,因此可大大降低检测成本。
依据上述公式分别给京津冀区域上市公司的债务结构进行打分。评分结果显示,排名前10的上市公司中仅来自河北省的企业就有6家,天津占3家,而北京仅有1家。而在排名前30的企业中,北京却有9家,说明其基本位居中后方;而河北省企业占据数量却仅比北京市多3家,说明其绝大多数都排名靠前;而天津市上市公司在前30名企业中的分布则相对均匀,与北京市的数量相等。
3 结 论
本文使用金电极作为工作电极,利用交流阻抗谱(EIS)技术建立了快速检测神经退行性关键蛋白——Tau蛋白的分析方法,且检测时间仅需15 min。通过构建自组装传感器,并使用[Fe(CN)6]3-/4-作为探针对传感器进行表征,证实该传感器能够实时检测Tau蛋白结合到电极表面引起的信号变化,同时通过搭建模拟电路获得阻抗值进行了分析。传感器检测结果表明,在Tau蛋白质量浓度为0.2~20 μg/mL范围内,阻抗值变化与其质量浓度呈线性关系,检出限为0.43 nmol/L。该传感器结合了电化学阻抗及免疫原理,在确保传感器特异性捕获的同时,大大提高了检测灵敏度,但与ELISA[12]和Western Blot等[13]非常完备的传统方法相比,在检出限上仍有不足[12-13]。
参考文献:
[1] Shi Z H,Ji Y.Chin.J.Geriatr.Heart Brain Vessel Dis.(石志鸿,纪勇.中华老年心脑血管病),2015,17(7):673-675.
[2] Liu Y,Cui D H.J.Neurosci.Mental Health(刘毅,崔德华.神经疾病与精神卫生),2007,7(3):165-168.
[3] Decarli C.Lancet Neurol., 2003,2(1):15-21.
[4] Li Y X,Cao M Y,Li Y M,Zhang Q Y,Shao H R.J.Hebei Med.College Continu.Edu.(李艳霞,曹梦媛,李艳萌,张庆云,邵海锐.医学研究与教育),2014,31(3):72-75.
[5] Avila J,Lucas J J,Pérez M,Hernández F.Physiol.Rev.,2004,84(2):361-384.
[6] Kosehasanogullari G,Ozakbas S,Idiman E.Clin.Neurpl.Neurosurgery, 2015,136:107-109.
[7] Esteves-Villanueva J O,Martic-Milne S.Anal.Biochem.,2016,496:55-62.
[8] Li Y X,Chen Y T,Huang L,Wang X P.Phys.Test.Chem.Anal.:Chem.Anal.(李艳霞,陈毅挺,黄露,王秀平.理化检验:化学分册),2015,51(12):1633-1638.
[9] Suprun E V,Arduini F,Moscone D,Pallenschi G,Shumyantseva V V.Electroanalysis,2012,24(10):1923-1931.
[10] Li Z M.Rapid Detection of Escherichia Coli and Aflatoxins in Food Based on Screen Printed Interdigitated Microelectrodes.Hangzhou:Zhejiang University (李占明.基于印刷叉指微电极快速检测食品中大肠杆菌和黄曲霉毒素.杭州:浙江大学),2016.
[11] Wang S X,Acha D,Shah A J,Hills F,Roitt I,Demosthenous A,Bayford R H.Biosens.Bioelectron., 2016,10:77-81.
[12] Luk C,Giovannoni G,Williams D R, Lees A J,de Silva R.J.Neurosci.Methods,2009,180(1):34-42.
[13] Shamir D B,Rosenqvist N,Rasool S,Pedersen J T,Sigurdsson E M.J.Alzheimer’s Assoc.,2016,12(10):1098-1107.