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一共两篇看看吧①生物科技小论文——草莓的无土栽培作者：孔凡阳 草莓的无土栽培摘 要：1、利用学校的生物园地，通过配制合理的营养液，完全 可以进行草莓的无土栽培。 2、无土栽培的草莓具有生长速度快、长势好、花芽分化 早、开花结果早、产量高的特点。 关键词：培养基、营养液、无土栽培、简单易行 将作物栽培在除土壤以外的培养基上，叫无土栽培。无土栽培具有不占地或少占地、换茬快、环境清洁、产品无污染和生长好、品质优、色鲜味美等优点，为花卉蔬菜、粮食以及水果生产的工业化、自动化开辟了广阔的前景。一、实践目的 通过对草莓的无土栽培实践活动，使我们初步掌握无土栽培的技术，懂得利用水培法来确定植物必须矿质元素的原理和矿质元素对植物的生理作用，同时也培养了同学们的学习兴趣和实践能力。二、实践原理 植物根从土壤溶液中吸收水分和无机盐，土壤颗粒主要起着固着作用。根据这一原理，将植物生活所需的无机盐按一定比例配成营养液进行作物的无土栽培。三、实践方法 采用与泥土盆栽草莓相对照试验，盆栽草莓使用一般的菜园土作固着物，施用化肥和农家肥，进行水肥管理。四、实践器材 无土花盆（双层塑料套盆或采用罐头瓶、硬泡沫塑料做定植板也行）、草莓苗、营养液原液、天平、洗净的碎石或蛭石、温度计等。五、 试验与管理 1、试验时间：1997年9月－1998年5月；1998年9月－1999年5月 2、试验地址：校生物园 3、营养液原液：经试验得知，表1为最佳配方。 4、栽培方法：选择无病虫害、植株矮壮、具4－5片叶、顶芽饱满的壮苗，洗净根上泥土后，定植在无土花盆的上盆中，用碎石子或蛭石作固着物，下盆中盛清水，待长出新根后（1周左右）将清水倒掉，换上培养液。 表1 无土栽培草莓营养液原液配方成分名称 含量（MG/L） 硝酸钙 236 硝酸钾 303 磷酸铵 57 硫酸镁 123 三氯化铁 500 硼 酸 2 氯化锰 725、管理： （1）及时添加营养液。每周补液1－2次。每次50－100ml。进入4月份以后，气温升高、蒸发快，同时正当开花、结果盛期，需肥量大，每2－3天补液1次，并要增加营养液的浓度。一般开花前培养液浓度是原液∶水＝1∶9开花后培养液浓度为原液∶水＝7∶3 （2）隔天上午喷水1次，4月开始每天喷水1次，保持相对湿度70－80％。 （3）光照为生物园里的自然光照（注意不要放在直射太阳光下，以免培养液温度升得过高造成根坏死）。 （4）注意及时摘除老叶、匍匐茎。当发现植株下部的叶片呈水平着生，开始发黄、叶柄基部也开始变色时，应立即摘除。匍匐茎消耗养分大，为保证果大质优，发现生在叶片基部的幼嫩线状物——匍匐茎，要及时摘除。 （5）注意病虫害防治。草莓虫害主要有蚜虫和红蜘蛛，可用内吸杀虫剂防治，如甲胺磷、乐果等。病害主要有灰霉病、病毒病等，可用波尔多液、托布津等杀菌剂防治。 （6）注意及时疏蕾垫果。六、观察记录情况 1、根系在2℃时开始活动，在7℃时开始长新根，最适生长温度为15－20℃，高于30℃时停止生长，并有根部变色受害情况，在－8℃时根系受到冻害。 2、地上茎、叶气温在5℃时开始生长，生长最适气温为15－25℃气温过高过低生长都较缓慢，气温高于30℃以上有老叶焦边现象。 3、气温在5℃以上开始花芽分化，花芽分化最适气温在5－15℃之间，开花在10℃以上，开花盛期在15℃左右。 4、培养液pH值在5-7最为适宜。 5、开花结果情况见下表表2 无土栽培草莓开花结果记录统计表盆数 盆栽时间 第一花序 第二花序 总果实／株 月／日 叶片数 开花月／日 小花朵数 果实成熟月／日 开花月／日 小花朵数 果实成熟月／日 数量 重（克） 20 9／239／26 4－5 3／234／6 11－17 4／124／27 4／104／21 5－9 4／205／18 9－171 53－257七、结果与体会 1、无土栽培的草莓比盆栽草莓生长速度快、长势好、花芽分化

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答案是：B。B项是错误的，田鼠的摄食量减去粪便量即为同化量。D项是正确的，田鼠的同化量是7乘以10的9次方，下一营养级最多得到它20%的能量，也就是40乘以10的9次方。

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微生物技术在城市生活垃圾处理中的应用 摘要：本文结合堆肥化、卫生填埋两种现行的城市生活垃圾处理工艺，主要介绍了城市生活垃圾生物处理过程中的微生物种群，以及通过分析开发出的新的微生物技术，指出了应用于城市生活垃圾处理的高效的微生物技术的研究方向。 关键词：城市生活垃圾 微生物 强化微生物处理技术 基因工程 ; 随着城市化进程在全球范围的加速，城市化带来的污染和人类聚居状况恶化等问题，已成为世界各国共同关心的问题。城市生活垃圾（Municipal solid waste， 简称MSW）是在城市日常生活及为城市生活提供服务的活动中产生的固体废弃物，是城市环境的主要污染物之一。目前，城市生活垃圾处理处置的方法主要包括卫生填埋（Sanitary landfill）、堆肥化(Composting)、焚烧(Incineration)三种，其中前两种处理方式均属于生物处理技术。具体来说，MSW生物处理技术就是城市生活垃圾中固有的或外添加的微生物，在一定控制条件下，进行一系列的生物化学反应，使得MSW中的不稳定的有机物代谢后释放能量或转化为新的细胞物质，从而MSW逐步达稳定化的一个生化过程。 城市生活垃圾生物处理中主要的微生物。。。

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Title（题目）简明扼要的说出重点Author（作者）按贡献大小排序，并注明工作单位或研究室Abstract（摘要）简要介绍实验的流程、方法、得出的结论Keywords（关键词）为了便于别人搜索而设置，尽量不与题目中的词重复Introduction（前言/简介）描述前人在这方面努力的成果，以及自己实验的目的和动机 以下2个顺序可以换Materials and Methods（材料和方法）描述实验材料和实验的流程及方法，尽可能详细，所用的物质、含量、时间、对照等都要描述清楚，在这个部分不要写实验结果Results（结果）图文并茂描述实验结果，顺序与实验步骤一一对应，所有的图表都要有相应的描述，可以简要分析实验结果，不一定要有误差分析 Discussion（讨论）对实验结果进行总体总结，评估优劣，指出问题，以及可能的改进方案，发散思维，产生新的问题，表示“有待进一步的研究”Acknowledgments（致谢）对那些帮助你实验或提供材料和设备的个人或组织进行感谢References（参考文献及资料）罗列你在实验过程中（从实验设计到结果分析）所参考的前人文章的作者、文章名字、发表杂志、发表日期、以及在杂志上的具体页数 如果有需要，还可以加上“支持信息”或者“附表” 大概是这样，有问题再问

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有没有主题啊 有主题的话 就很简单的格式如下： 题目作者关键词：摘要：论文正文：结论：参考文献：这就是论文的格式啊。你可以去搜索一片论文 下载下来模仿下。你也可以吧主题告诉我 我帮你看看

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1、论文格式的论文题目：（下附署名）要求准确、简练、醒目、新颖。 2、论文格式的目录 目录是论文中主要段落的简表。（短篇论文不必列目录） 3、论文格式的内容提要： 是文章主要内容的摘录，要求短、精、完整。字数少可几十字，多不超过三百字为宜。 4、论文格式的关键词或主题词 关键词是从论文的题名、提要和正文中选取出来的，是对表述论文的中心内容有实质意义的词汇。关键词是用作计算机系统标引论文内容特征的词语，便于信息系统汇集，以供读者检索。每篇论文一般选取3-8个词汇作为关键词，另起一行，排在“提要”的左下方。 主题词是经过规范化的词，在确定主题词时，要对论文进行主题分析，依照标引和组配规则转换成主题词表中的规范词语。（参见《汉语主题词表》和《世界汉语主题词表》）。 5、论文格式的论文正文： （1）引言：引言又称前言、序言和导言，用在论文的开头。引言一般要概括地写出作者意图，说明选题的目的和意义， 并指出论文写作的范围。引言要短小精悍、紧扣主题。 〈2）论文正文：正文是论文的主体，正文应包括论点、论据、论证过程和结论。主体部分包括以下内容： 提出问题-论点； 分析问题-论据和论证； 解决问题-论证方法与步骤； 结论。 6、论文格式的参考文献 一篇论文的参考文献是将论文在研究和写作中可参考或引证的主要文献资料，列于论文的末尾。参考文献应另起一页，标注方式按《GB7714-87文后参考文献著录规则》进行。 中文：标题--作者--出版物信息（版地、版者、版期） 英文：作者--标题--出版物信息 所列参考文献的要求是： （1）所列参考文献应是正式出版物，以便读者考证。 （2）所列举的参考文献要标明序号、著作或文章的标题、作者、出版物信息。搜索一下 品学论文网 上面什么专业的都有经济学 经济学 国际经济与贸易 财政学 金融学 国民经济管理 保险 金融工程 税务 信用管理 投资学 环境经济/环境资源与发展经济学 管理学 酒店管理 管理科学与工程 信息管理与信息系统 工业工程 工程管理 工程造价 产品质量工程 项目管理 工商管理 市场营销 会计学财务管理 人力资源管理 旅游管理 审计学 电子商务 物流管理 国际商务 物业管理/房地产 连锁经营管理 资产评估 行政管理公共管理/公共事业管理 劳动与社会保障 土地资源管理 城市管理 文化产业管理 会展经济与管理 航运管理 劳动关系公共安全管理/应急管理 体育产业管理 农林经济管理 农村区域发展 图书馆学 档案学 信息资源管理 理学 数学与应用数学/金融数学 信息与计算科学 物理学 应用物理学 声学 化学 应用化学 化学生物学 生物信息学/生物信息技术生物科学与生物技术(动物植物生物技术) 动植物检疫 天文学 地质学 地球化学 地理科学 资源环境与城乡规划管理 地理信息系统地球信息科学与技术 地球物理学 大气科学 应用气象学 海洋科学与技术(渔业) 海洋管理 军事海洋学 海洋生物资源与环境 理论与应用力学电子信息科学与技术 微电子学 光信息科学与技术 信息安全(信息科学技术) 光电子技术科学 材料物理 材料化学 环境科学 生态学资源环境科学 心理学 应用心理学 统计学 系统科学与工程 教育学 教育学 学前教育 特殊教育 教育技术学 小学教育 人文教育 科学教育 华文教育 体育教育 运动训练 社会体育 运动人体科学民族传统体育 运动康复与健康 农艺教育 园艺教育 林木生产教育 特用作物教育/特用动物教育 水产养殖教育 应用生物教育 农业机械教育农业建筑与环境控制教育 农产品储运与加工教育 农业经营管理教育 机械制造工艺教育 机械维修及检测技术教育 机电技术教育(电气) 汽车维修工程教育 应用电子技术教育 印刷工艺教育 食品工艺教育 纺织工艺教育 化工工艺教育 建筑工程教育 服装设计与工艺教育装潢设计与工艺教育 食品营养与检验教育 财务会计教育 文秘教育 职业技术教育管理 医学 基础医学 预防医学 卫生检验 妇幼保健医学 营养学 临床医学 麻醉学 医学影像学 医学检验 眼视光学 精神医学 听力学 医学实验学医学美容技术 口腔医学 中医学 针灸推拿学 蒙医学 藏医学/藏药学 中西医临床医学 法医学 护理学 药学 中药学 药物制剂中草药栽培与鉴定 中药资源与开发 法学 法律/法学 科学社会主义与国际共产主义运动 中国革命史与中国共产党党史 社会学/社会工作 家政学 人类学 政治学与行政学国际政治(国际事务与国际关系) 外交学 思想政治教育 国际文化交流 国际政治经济学 治安学 侦查学 边防管理/边防指挥 火灾勘查禁毒学 警犬技术 经济犯罪侦查 消防指挥 警卫学 公安情报学 犯罪学 公安管理学 国际经济法 历史学 历史学 世界历史 考古学 博物馆学 民族学 文物保护技术

1、论文题目：要求准确、简练、醒目、新颖。　　2、目录：目录是论文中主要段落的简表。（短篇论文不必列目录）　　3、提要：是文章主要内容的摘录，要求短、精、完整。字数少可几十字，多不超过三百字为宜。　　4、关键词或主题词：关键词是从论文的题名、提要和正文中选取出来的，是对表述论文的中心内容有实质意义的词汇。关键词是用作机系统标引论文内容特征的词语，便于信息系统汇集，以供读者检索。 每篇论文一般选取3-8个词汇作为关键词，另起一行，排在“提要”的左下方。　　主题词是经过规范化的词，在确定主题词时，要对论文进行主题，依照标引和组配规则转换成主题词表中的规范词语。　　5、论文正文：　　（1）引言：引言又称前言、序言和导言，用在论文的开头。 引言一般要概括地写出作者意图，说明选题的目的和意义， 并指出论文写作的范围。引言要短小精悍、紧扣主题。　　〈2）论文正文：正文是论文的主体，正文应包括论点、论据、 论证过程和结论。主体部分包括以下内容：　　提出-论点；　　分析问题-论据和论证；　　解决问题-论证与步骤；　　结论。　　6、一篇论文的参考文献是将论文在和写作中可参考或引证的主要文献资料，列于论文的末尾。参考文献应另起一页，标注方式按《GB7714-87文后参考文献著录规则》进行。　　中文：标题--作者--出版物信息（版地、版者、版期）：作者--标题--出版物信息　　所列参考文献的要求是：　　（1）所列参考文献应是正式出版物，以便读者考证。　　（2）所列举的参考文献要标明序号、著作或文章的标题、作者、出版物信息。

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【食品与营养科学】说了这么一句话：随着人民生活水平的提高，生活节奏的加快，食品消费结构的变化，促进了我国食品工业的快速发展，要求食品方便化，多样化，营养化，风味化和高级化，为了达到这些要求就离不开食品添加剂。论文这件事儿，是得你自己好好思考的~

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论文题目 7148 生物论文 植物抗污染分化进化研究进展及其分子生物学技术 [CN级论文] 588 7158 生物论文 植物抗污染分化进化研究进展及其分子生物学技术的应用* [CN级论文] 155 7042 生物论文 生物传感器的研究现状及应用 [CN级论文] 322 6796 生物论文 论生物教学中学生观察能力的培养 464 6388 生物论文 生物识别技术的发展概况及指纹识别的应用 130 5975 生物论文 浅谈生物学课堂自学的指导摘要 [CN级论文] 佚名 179 6076 生物论文 信息技术的生物学教学模式与整合[CN级论文] 佚名 112 6064 生物论文 谈创造性思维在生物教学中的培养 佚名 235 6062 生物论文 乡镇中学生物学教学浅谈 佚名 206 5998 生物论文 谈中学生物的教与学[CN级论文] 佚名 187 4476 生物论文 生物学新课程呼唤课程资源的开发和利用 佚名 344 4449 生物论文 浅谈农村中小学综合课程的设置与管理 [CN级论文] 佚名 114 4143 生物论文 略论生物学教学中的“生物学语言” 佚名 218 4134 生物论文 试论高中生物实验分析的一般方法 佚名 164 4150 生物论文 中学生物教学模式的一种新探索 佚名 301 4149 生物论文 趣味教学在生物教学中的应用 佚名 524 4148 生物论文 中学生物教研工作的困境与对策 佚名 107 4147 生物论文 高中生物教材加强辩证唯物主义观点教育初探 佚名 131 4146 生物论文 在生物教学中培养学生的科学素质 佚名 349 4145 生物论文 生物教学中应注意“度”的把握

微生物技术在城市生活垃圾处理中的应用 摘要：本文结合堆肥化、卫生填埋两种现行的城市生活垃圾处理工艺，主要介绍了城市生活垃圾生物处理过程中的微生物种群，以及通过分析开发出的新的微生物技术，指出了应用于城市生活垃圾处理的高效的微生物技术的研究方向。 关键词：城市生活垃圾 微生物 强化微生物处理技术 基因工程 ; 随着城市化进程在全球范围的加速，城市化带来的污染和人类聚居状况恶化等问题，已成为世界各国共同关心的问题。城市生活垃圾（Municipal solid waste， 简称MSW）是在城市日常生活及为城市生活提供服务的活动中产生的固体废弃物，是城市环境的主要污染物之一。目前，城市生活垃圾处理处置的方法主要包括卫生填埋（Sanitary landfill）、堆肥化(Composting)、焚烧(Incineration)三种，其中前两种处理方式均属于生物处理技术。具体来说，MSW生物处理技术就是城市生活垃圾中固有的或外添加的微生物，在一定控制条件下，进行一系列的生物化学反应，使得MSW中的不稳定的有机物代谢后释放能量或转化为新的细胞物质，从而MSW逐步达稳定化的一个生化过程。 城市生活垃圾生物处理中主要的微生物。。。 采纳哦

分子生物技术在微生物降解环境 污染物中的应用 [摘要〕介绍了与环境微生物关键降解酶基因的筛选、克隆及应用相关的分r生物技术，包括聚合酶链式反应技 术、基因重组技术、荧光原位杂交技术和生物信息学等技术，并对这些技术在污染物降解基因检测、筛选和克隆方 面的应用进行了阐述与探讨、 [关键词]分子生物技术;微生物;基因;环境污染物;降解 随着现代j:/地技术的发展，多环芳烃、含氯有 机物和硝基苯类化合物等人工合成井难以降解的 污染物大量排放，造成世界范围内的环境污染和生 态破坏，严重地威胁人类和其他生物的正常生存和 发展。利用微生物修复技术对受污染的水体及土 壤进行处理，凸显了其重要的意义和可行性。研究 人员发现并筛选到一些微生物，它们不仅对环境有 较高的适应性、对污染物有较高的耐受性，而且对 污染物有较强的降解效率和专一性。然而环境中 存在的大量微生物中仅有少于1%可通过传统的培 养方法进行培养、分离和纯化，绝大多数细菌需要 非常严格的营养条件川。因此，为了对修复环境有 所贡献却难以培养的微生物进行更全面了解，也为 了筛选到更多有利于降解环境污染物的微生物菌 种及其关键酶基因，分子生物技术和手段逐渐被广 泛应用到环境可降解污染物及降解机理方面的研 究中。 本文对近年来发展起来的聚合酶链式反应 (PCR)技术、基因重组技术、荧光原位杂交(FISH) 技术和生物信息学等多种分子生物技术进行了介 绍，并总结了它们在污染物降解基因检测、筛选和 克隆方面的应用。 1与环境污染物降解相关的分子生 物技术 1PCR及其相关技术 PCR是一种利用脱氧核糖核酸(DNA)半保留 复制原理，在体外扩增位于两段已知序列之间的 DNA区段从而得到大量拷贝的分子生物技术。根 据其模板、引物来源或扩增条件的不同，PcR技术 可分为以下几种:(l)反转录pCR(RT一PeR)技 术，将mRNA反转录为cDNA后再对其进行PCR 扩增，可用来构建cDNA文库，分析不同生长时期 的mRNA表达状况和相关性以及mRNA的定量测 定等;(2)巢式PCR技术，在扩增大片段目的DNA 时，先用非特意性引物扩增再用特意性引物对第一 次扩增产物进行第二次扩增，以获得可供分析的 DNA;(3)竞争PCR技术，是一种定量PCR，向PCR 反应体系中加人人工构建的带有突变的竞争模板， 通过控制竞争模板的浓度来确定目的模板的浓度， 对目的模板作定量研究;(4)实时荧光定量PCR技 术，在PCR反应体系中加人荧光基团，利用荧光信 号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线 对未知模板进行定量分析，该法已广泛用于基因表 达研究、转基因研究等方面;(5)扩增的rDNA限制 酶切分析技术，根据原核生物rDNA序列的保守性， 将扩增的rDNA片段进行酶切，通过酶切图谱来分 析菌间的多样性;(6)RNA随机引导PCR技术，基 于任意寡核昔酸引物与RNA之间可能的配对，在 低严谨度条件下经聚合酶催化使链延伸，将细胞总 RNA或InRNA作为反转录反应的模板，此技术结 合单链构象多态性，用非变性胶分辨大小相同而构 象不同的片段，可用于诊断遗传突变及分析污染条 件下序列的多态性;(7)随机扩增多态DNA (RAPD)技术，是一种基于PCR检测PCR引物结合 位点序列改变的方法，通常以10bp的寡核昔酸序 列为引物，对基因组DNA随机扩增，电泳分离染色 扩‘增产物，再分析多态性。 2FISH技术 FISH技术利用荧光标记的探针在细胞内与特 异的互补核酸序列杂交，通过激发杂交探针的荧光 来检测信号。荧光探针比放射性探针更安全，具有 较好的分辨力，不需要额外的检测步骤。近年来， 由于FISH技术具有灵敏、便捷等优点，迅速发展完 善成为研究环境微生物的有力工具。此外，可用不 同激发和散射波长的荧光染料标记探针，在一步反 应中同时检测几个靶序列。该技术主要包括试样 固定、预处理、预杂交、探针和试样变性、杂交、漂洗 去除未结合的探针、检测杂交信号等步骤。由于 165rRNA具有遗传稳定性，因此成为FISH技术检 测最常用的靶序列。 3基因重组技术 基因重组技术是从供体生物的基因组中通过 酶切扩增等手段获取目的基因，与载体连接形成重 组DNA分子，再导入到受体细胞中，让外源基因得 以表达。在已经分离出的许多菌株中，与降解能力 有关的基因多在质粒体上。由于质粒很容易在细 菌的繁殖过程中遗失，对细菌降解能力的长期稳定 非常不利，可将其与污染物降解有关的酶基因重组 到大肠杆菌等微生物中进行表达，以此构建的各种 生物降解特性增强的重组菌可用于污染环境的治 理修复或发酵某些废弃物。 4生物信息学 20世纪后期，生物学的迅猛发展，从数量上和 质量上极大地丰富了基因组数据库、蛋白质数据 库、酶数据库和文献数据库等许多生物科学的数据 资源。已有多个国家和国际科研组织建立了生物 信息数据库，如欧洲分子生物学实验室(Eur叩ean MolecularBiologyLaboratory)核酸序列数据库和美 国国家生物技术情报中心(Nationaleente:fo:Bio- technologyInformation，NCBI)基因序列数据库等。 科学家利用计算机及生物信息分析软件分析这些 数据资源，确定大分子序列、结构、表达模式和生化 途径与生物数据之间的关系，区分生物个体间遗传 差异，揭示DNA多样性。例如，基本局部比对搜索 工具(BasieLoealAlignmentSearehTool，BLAST)， 是一套在蛋白质数据库或DNA数据库中进行相似 性比较的分析工具。它基于Altschul等的方法「2〕， 在序列数据库中对查询序列进行同源性比对工作。 BLAST程序可对一条或多条、任何数量、任何形式的 序列在一个或多个核酸或蛋白序列库中进行比对，甚 至将有缺口的比对序列也考虑在内，利用比较结果中 的得分对序列进行相似性说明。基因的序列分析可 揭示出生物物种之间的关系，在污染治理研究中可用 于生物基因组特殊区域或特异基因的测序。 2分子生物技术在环境污染物降解 中的应用 1土壤试样总DNA的提取 用适当方法直接从土壤中提取DNA并纯化， 是从分子生物学角度对土壤微生物进行研究的前 提条件，而后可进行酶切、PCR扩增、核酸分子杂交 等分子生物学技术操作。从土壤中提取微生物 DNA主要分为汽接法和间接法}’{。直接法是在 ogram等的方法基础卜发展起来的，其主要包括2 个步骤:(l)原位细胞裂解;(2)DNA提取和纯化。 直接法提取的DNA超过细菌总DNA的60%且省 力，但提取的DNA常常有折断、腐殖酸污染、甚至 提取物中还夹杂有未知的胞外DNA和真核生物的 DNA。最先报道间接法的是Faegri等[‘〕，其主要包 括4个步骤:(l)分散土壤;(2)分离细胞与土壤; (3)细胞裂解;(4)DNA纯化。间接法提取DNA 产量低且费力，但纯度较高、DNA损伤小，提取的 大片段DNA可用来构建cos而d和细菌人工染色体 文库等。 2采用PCR及相关技术扩增分析DNA片段 可降解污染物的微生物必然能产生分解代谢 该污染物的酶。selvaratnam等L’l用编码苯酚单加 氧酶dmpN摹因的RT一PCR技术来检测序列间歇 式活性污泥反应器‘{一，降解酚的假单胞菌。检测结 果表明，RT一PCR技术不仅能检测微生物降解酚的 能力，还能测量dmpN基因的转录水平，从而确定假 单胞菌特殊的分解活性，发现了在转录水平下，酚 浓度与通气时间之问存在正相关关系。 将PCR技术和变性梯度凝胶电泳(DGGE)结 合起来，在变性条件适当的情况下能分辨一个碱基 对，分辨率较高。染色后的凝胶用成像系统进行分 析，可在一定程度l几反应试样的复杂性。条带的多 少能反应试样「 一 }1微生物组成的差异，条带的亮度能 反应试样中微生物的多少。基于以上优点，日前该 技术在微生物群落结构的分析和动态研究方面得 到了厂‘泛应用。DGGE可通过分析PCR扩增的基 因点突变来探索微生物的复杂性。徐玉泉等[“〕从 某废水中分离出一株能以苯酚为惟一碳源的菌株 PHEA一2，使用PCR一DGGE技术对该菌165 rDNA进行分析，发现该菌与醋酸钙不动杆菌同源。 M盯sh等r了)利用PcR一DGGE技术获得了活性污泥 中真核微生物的种群变化情况。王峰等下8〕采用 PCR一DGGE技术对城市污水化学生物絮凝处理中 活性污泥和生物膜微生物种群结构进行了分析，结 果表明活性污泥培养前后微生物种群结构发生r 很大改变。 RAPD技术也是一种应用比较广泛的以多态性 引物来扩增某些片段的技术。RAPD技术可用于检 测含有混合微生物种群的各种微生物反应器中微 生物的多样性。用RAPD技术分析检测实验室规 模的油脂淤泥培养料中的细菌菌群发现，用油脂淤 泥改良过的培养料比未改良的更适于不同的微生 物种群生长[9j。vainio等t’。〕从516种孤立的菌落 中提取出165rDNA，经PCR扩增后进行测序，检测 活性污泥中微生物种群的结构。这些组合技术的 应用显著增强r对微生物的检测和鉴定能力，为理 论研究工艺优化及提高生物处理效率提供了条件。 3基因重组 基因工程技术应用于环境保护起始于20世纪 80年代。其基本原理是通过基因分离和重组技术， 将目的基因片段，比如可编码降解某种污染物的 酶，转移到受体生物细胞中并表达，使受体生物具 有该目的基因表达显现的特殊性状，从而达到治理 污染的目的。找到特定污染的抗性基因，利用基因 重组技术转基因后也可获得其他抗性植株以及筛 选到可转化污染物的植物，还可开发超量积累植物 进行污染土壤的生物修复。 罗如新等L”〕用放射性同位素标记tfdc基因片 段作探针，Southemblot杂交定位Ll菌株的邻苯二 酚1，2一双加氧酶基因位于Pstl的I片段和BamH I的M、N片段，回收并将其直接克隆至表达载体 pKT230卜，获得的重组子能转化不具开环酶活性 的甲胺磷降解菌P2，得到高于天然宿主21倍的邻 苯二酚1，2一双加氧酶。stingley等{”〕通过构建基 因文库和重组质粒等基因工程方法证实了NidAB 双加氧酶是降解菲的关键酶类，并首次鉴定出此基 因通过磷苯二甲酸实现降解功能。chae等‘”}发现 不能降解苯酚的su如lobusso扣taricu、98/2菌株中 的儿茶酚2，3一双加氧酶基因与能降解苯酚的 sulfolo右u，，o如taricu、咫有[6J源区，分析得知它们 是山共同祖先进化而来。把儿茶酚2，3一双加氧酶 基因克隆到大肠杆菌中表达，可获得有较高降解活 性的双加氧酶。 重金属污染是环境污染的重要方面之一。随 着分子生物学技术的发展，越来越多的修复性蛋白 基因正被从植物、微生物和动物中陆续分离出来， 如汞离子还原酶基因、有机汞裂解酶基因、汞转运 蛋自基因、金属硫蛋白基因、植物络合素合成酶基 因、铁离子还原酶基因和锌转运蛋白基因L’‘〕。这些 基因通过基因工程的改造，重组到合适的受休细胞 中表达相应的蛋白质和酶，达到治理难以降解的有 毒有害污染物的目的。sorsa等〔”〕把MTS插人 LamB序列的153位点，在Eli中表达MTs，解决 r细胞内MTs对金属离子有限的吸附能力。综L 所述，基因重组技术具有快速、高效的特性，已逐渐 成为环境生物技术的研究热点。 4FISH技术 FISH技术利用核糖体内长度适中(约1500bp)、 高度保守的165:RNA序列作为理想的基因分类靶 序列，其中使用的165:RNA寡核普酸探针一般是 进行了荧光标记的20bp左右特异性核昔酸片段， 利用该报告分子(如生物素、地高辛)与荧光素标记 的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测系 统对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。 FISH技术能提供处理过程中微生物的数量、空间分 布和原位生理学等信息。 硝化细菌是一类生理上非常特殊的化能自氧 菌，传统的研究方法要经过富集、分离、分类和鉴定 步骤，耗时长。HSH技术的引人解决了上述困难。 FlsH技术还被广泛用于活性污泥系统、硝化流化床 反应器和膜生物反应器等废水处理系统}’61。 基因工程微生物越来越多地被用于农业害虫 控制和环境污染的生物修复，对人类健康和环境的 影响引起广泛关注。1994年出现了一种新的标记 系统:绿色荧光蛋白(GFP)，由于GFP基因表达产 物对细胞没有毒害作用，且由GFP产生的荧光标记 检测卜分方便、简单。在某些被污染的环境中可分 离出降解该污染物的细菌，通过基因重组等手段使 用GFP分子标记，可更容易的分离检测被标记的 细胞叫。 Bastes等[’8]进行了苯酚降解菌染色体GFP基 因标记实验。通过PCR和Southemblot分析，证明 GFP基因已成功整合到宿主细胞的染色体中。对 标记菌与野生型的降解能力比较结果证明，GFP分 子标记的插人并不影响细胞的苯酚降解能力。 用G即标记Pseudomonasputida，研究活性淤 泥中细菌存活情况{’9飞。Pseudomonasputida被转到 活性淤泥2min后，观察到细胞在淤泥絮凝物间自 由游动;培养3d后，发现荧光细胞减少，大部分已 被合并到淤泥絮凝物中，以防止细菌被原生动物捕 食。用oFP标记石zi和Serraliamarceseern，考 察菌株附到絮凝物卜的过程{’()j。使用表面荧光显 微镜能将带有GFP标记的细胞从活性污泥中区分 开，井进行观察和记数。而聚焦激光扫描显微镜 (cLsM)可使GFP标记细菌产生三维轮廓，结合表 面荧光显微镜和CLSM观察GFP标记细胞，结果表 明，细胞表面疏水性在细菌附到絮凝物的过程中起 重要作用，两种细菌附在絮凝物上的模式有很大不 同，通过这种方法可更好地理解细菌赫附机理，有 助于提高废水处理效果。 3结语 分子生物技术的应用使研究人员可从微观的 角度更细致深人地了解微生物对污染物降解的具 体生理生化机制，在分子水平 _ _ [揭示生物体吸收、 迁移、积累有害物质最终被毒害，及适应、抗性等生 态问题，从而筛选到更多有利用价值的微生物。随 着越来越多微生物全部基因序列的解码，对各种细 菌体内可降解基因的分布和表达会有更深人的了 解，有关技术的发展和成熟必将对污染物的降解过 程有一个整体的、生态水平上的认识。 参考文献 l李凤，刘世贵 分子生物学技术在环境微生物研究中的 应用 世界科技研究与发展，2003，25(4):88一92 2AltsehulSF，GishW，MillerW，Basieloealalign- mentsearehtool JMolBiol，1990，215(3):403一410 3魏志琴，曾秀敏，宋培勇 土壤微生物DNA提取方法研 究进展 遵义师范学院学报，2006，8(4):53一56 4FaegriA，TorsvikVL，GoksoyrJBaeteria]andfunga] aetivitiesin5011:seParationofbacteriaandfungibyaraPid fraetionatedeentrifugationteehnique5011BiolBioehem， 1977，9(2):105一112 5SelvaratnamS，SehoedelBA，MeFarlandBL，etal APPlieationofreversetranseriPtasePCRformonitoring exPressionoftheeataboliedmPNgeneinaPhenol- degradingsequencingbatehreaetor APPIEnviron Microbiol，1995，61(11):3981一3985 6徐玉泉，张维，陈明等 一株苯酚降解菌的分离和鉴 定 环境科学学报，2000，20(4):450一455 7MarshTL，LiuWT，ForneyLJ Beginningamoleeular analysisoftheeukiU洲 WaterSeiTechnol，1998，37(4一5):455一460 8王峰，傅以钢，夏四清等PCR一DGGE技术在城市污 水化学生物絮凝处理中的特点 环境科学，2004，25 (6):74一79 9涂书新，韦朝阳 我国生物修复技术的现状与展望 地 理科学进展，2004，23(6):20一31 10VainioEJ，MoilanenA，KoivulaTT，etal ComParison ofpartial165rRNAgenesequeneesobtainedfromactiva- tedsludgebaeteria APPIMierobiolBioteehnol，1997，48 (l):73一79 11罗如新，张素琴，李顺鹏 邻苯二酚1，2一双加氧酶

基因工程制药------浅谈　　摘要： 主要介绍基因工程的概念、基因工程技术开发药物的一般过程及基因工程药物，同时探讨了今后利用基因工程技术进行药物开发、研究的发展方向。　　正文：　　1 基因工程概述　　所谓的基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之参入到原先没有这类分子的寄主细胞内，而能持续稳定地繁殖。　　基因工程的第一个重要特征是跨越天然物种屏障的能力，即把来自任何一种生物的基因放置在与其毫无亲缘关系的新寄主生物细胞中去的能力。这表明人们有可能按照主观愿望创造出自然界中不存在的新物种。第二个特征是，它强调了一种确定的DNA小片段在新寄主细胞中进行扩增的事实．才能制备到大是纯化的DNA片断，从而拓宽了分子生物学的领域，使之在生物制药领域有巨大的应用。　　基因工程自从20世纪70年代初期问世以来，无论是在基础理论研究领域，还是在生产实际应用方面．都已经取得了惊人的成绩。基因组核苷酸全序列的测定与分析，是基因工程技术促进基础生物学研究的一个出色范例。2001年2月12 日，由6国的科学家共同参与的国际人类基因组公布了人类基因组图谱及初步分析结果，这结果为人们提供了约3000 多个基因可用来制药，将推进基因制药产业的快速发展。由于基因克隆技术的发展，已使得基因工程技术在工业生产尤其是制药生产中发挥了重要作用。以前人们利用微生物自身生产有用的产品，如利用青霉菌生产青霉素、利用链霉菌生产链霉素等。但是从这些生物体中分离纯化这些药物，不仅成本昂贵，而且技术上也相当困难。如今将编码这些药物的基因克隆并转移到合适的生物体内进行有效的表达，就可以方便地提取到大量的有用药物。　　2 基因工程技术开发药物的一般过程　　利用基因工程技术开发一个药物，一般要经过以下几个步骤：①目的基因片断的获得：可以通过化学合成的方法来合成已知核苷酸序列的DNA片段；也可以通过从生物组织细胞中提取分离得到，对于真核生物则需要建立cDNA文库。 ②将获得的目的基因片断扩增后与适当的载体连接后，再导入适当的表达系统。③在适宜的培养条件下，使目的基因在表达系统中大量表达目的药物。④将目的药物提取、分离、纯化，然后制成相应的制剂。　　以上方法大部分是以微生物或组织细胞作为表达系统．通过微生物发酵或组织细胞培养来进行药物生产。近年来，通过转基因动物来进行药物生产的"生物药厂"成为目前转基因动物研究的最活跃的领域，也是基因工程制药中最富有诱人前景的行业。转基因动物制药具有生产成本低、投资周期短、表达量高、与天然产物完全一致、容易分离纯化等优势，尤其是适合于一些用量大、结构复杂的血液因子，如人血红蛋白（Hb）、人血白蛋白（HSA）、蛋白C（Protein C）等。英国的爱丁堡制药公司通过转基因羊生产α1-抗胰蛋白酶（α1-AAT）用于治疗肺气肿，每升羊奶中产16g AAT，占奶蛋白含量的 30%，估计每只泌乳期母羊可产70g AAT。另外，转基因植物制药比转基因动物制药更为安全，因为后者有可能污染人类的病原体。目前，已经开发出许多转基因植物药物，例如脑啡肽、α-干扰素和人血清蛋白，以及两种最昂贵的药物即葡萄糖脑苷脂酶和粒细胞-巨噬细胞群集落因子等。　　3 基因工程药物　　基因工程药物自20世纪70年代末期以来，有了飞跃的发展。1978年首次通过大肠杆菌生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素，1980年美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以获得专利．1982年第一个由基因工程菌生产的药物--胰岛素．在美国和英国获准使用以来，各种基因工程药物犹如雨后春笋，得到了蓬勃发展。我国的医药技术的研发和产业化也取得了长足的进展。　　（1） 抗生素类 传统的抗生素生产，主要利用化学合成或微生物发酵来获得，其生产过程中菌种的表达水平比较低，生产成本比较高，而且在使用过程中容易产生耐药菌群。而利用基因工程技术可以对生产菌种进行基因改造，得到表达水平高、产品目的性强的菌株，如大肠杆菌生产青霉素酞胺酶。德国一个科研小组对生产半合成青霉素的材料6APA．用基因工程来增强大肠杆菌的青霉素酰胺酶活性。将大肠杆菌的基因 PBR322的质粒克隆化所形成的菌株，其酶活力比原株提高 50倍．从而提高6APA生产能力。我国王以光利用基因重组技术对螺旋霉素产生菌进行改造，增强了丙酰基转移酶的基因在螺旋霉素产生菌中的表达，并提高了丙酰螺旋霉素的产量。　　（2） 活性多肽类 在人体中存在一系列含量较低，但生理活性很高，而且在人体代谢过程中起着重要的调节作用的活性多肽类物质如激素等，这些物质在临床上可以作为药物来治疗相应的因此类物质失衡而造成的疾病。此类药物的制剂多来源于各种动物的脏器，生产方法复杂，成本高，个别产品还必须从动物的尸体中进行提取，无法进行大规模工业化生产，自基因工程技术问世以来，通过基因重组技术，可以由微生动进行生产，这是基因工程技术的最大成就之一，以下是这类药物中比较典型的两个。　　胰岛素： Genentech公司在1978年，由Goeddel等学者应用基因重组技术开发出使用大肠杆菌生产人胰岛素。随着基因工程技术的不断发展，生产胰岛素的工艺和技术也不断得到完善，在临床上已经完全取代了由动物脏器提取得到的产品。目前，我国新疆转基因羊已能够成功表达人胰岛素原，为胰岛素的生产开发了新途径。　　生长素： 人类生长素临床用于治疗侏儒症和肌肉萎缩症．传统制造方法是由人脑下垂体抽提精制而得，其原料来源困难，产量受到极大限制。全世界侏儒症患者中仅有1%可以得到治疗，原因是生长素价格极其昂贵，达每克5000美元。1979年Genentech公司由Goeddel等学者应用基因重组技术首先开发出使用大肠杆菌生产人生长素．近年来还开发了以酵母菌来生产生长素，其产量可达到4×106～7× 106分子/细胞。目前，我国基因工程人生长素已研制成功，并投入市场和用于临床使用。　　除上述药物外，运用基因工程技术生产的这类药物还有神经生长因子（PDGH）、人基底成纤维细胞生长因子、绒毛膜促性腺激素等。　　（3） 细胞免疫调节因子 基因工程技术用于细胞免疫调节因子的产品较多，临床广泛应用于抗肿瘤和免疫调节等。近年来，由于基因重组和细胞融合两大技术的进步，加上高压液相层析技术、氨基酸序列分拆装置以及蛋白质的精制和解析技术的改进，使一些调节细胞免疫活性物质的研究和开发得到快速发展，如干扰素（INF）、白介素（IL）、集落刺激因子（CSF）和肿瘤坏死因子（TNF）等。　　干扰素是其中研究较为广泛，技术比较成熟，产业化较早的一个产品。第一代干扰素是从血液中进行提取而得到。据芬兰的K Canted报道，处理23000L血液，所得纯度1%以下的干扰素不足100mg．所以产量很低。而且由于血源质量不能保证，可能造成血源性传染病的传播。第二代干扰素是采用基因工程技术进行生产的，其生产水平可达250000分子/细胞，每升可含5亿单位，成本显著下降，产品纯度很高，含量可达90%以上。目前，已经商品化的基因工程干扰素有α、 β、γ三种，而且生产技术也在不断完善。俄罗斯科学家构建了以假单胞菌为载体的表达系统来生产基因工程干扰素．与传统的大肠杆菌表达系统相比其培养周期短，细胞易于破碎便于提取。随着基因重组技术的不断发展，一些研究人员对干扰素基因进行改造，构建靶向干扰素基因及表达载体。夏小兵等利用限制性内切酶分别从含有抗乙型肝炎S抗原（HbSAg）人源单链抗体与人干扰素α质粒中切出目的基因，连接到 pET22b质粒中，构建成单链抗体靶向干扰素表达载体，在大肠杆菌中表达成功。　　（4） 疫苗传统的疫苗是病源微生物的减毒或灭活物质，但这些疫苗都不理想，有可能发生回复突变，恢复毒性；或者因为灭活不适当引起疾病流行。利用基因工程技术生产的新型疫苗，可以克服传统疫苗价格昂贵、安全性能差等缺点，能为目前尚无有效疫苗的某些特殊疾病如艾滋病，提供有效的治疗手段。　　第一个商品化的基因工程疫苗是抗人乙型肝炎病毒（HBV）的疫苗。我国大约有10% 的人口受到HBV的侵害， HBV的感染通常还与特殊的肝癌（HCC）有着密切的关系，每年全世界死于HCC的病人有30万左右。HBV具有高度的寄主专一性，只能感染人类和黑猩猩，这意味着只能从肝炎患者身上才能获得有限数量的病毒，供做疫苗使用，而且从患者血液中提取制备的疫苗，还有传染艾滋病的可能。利用基因工程技术生产的抗HBV疫苗克服了传统疫苗的缺点，质量和安全性高，用量极少，一般剂量为10mg以下，接种3次，为普通药品用量的千分之一。1982年P Valenzuela等人将S基因（HBV表面抗原基因）的一个片段克隆在一种载体上，结果在酵母中合成出来HBV表面抗原（HbsAg）颗粒，其产量达25 μg/L，酵母表达系统现在已经能够大规模生产供给人类使用的重组肝炎疫苗。　　大约20年前，人们发现"裸露"DNA注入体内能够诱发免疫反应，科学家们进行了大量研究，开发出了新型的核酸疫苗。所谓核酸疫苗，是指将编码某种抗原蛋白的外源基因（DNA或RNA）直接转移到动物体内，通过宿主表达系统合成抗原蛋白，诱导宿主对该抗原蛋白产生免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。现已开发出多种核酸疫苗，例如：流感核酸疫苗、艾滋病疫苗、狂犬病疫苗、结核病疫苗和乙型肝炎疫苗和戊肝疫苗等。　　（5） 基因治疗制品 基因治疗在1990年开始进行实验， 1993年美国FDA给人类基因治疗下的定义为："基于对活性细胞遗传物质的改变而进行的医学治疗，这种改变可以在活体外进行，然后应用于人体，或者直接在人体内进行"。因此，基因治疗存在两种方式，即间接体内法和体内法。间接体内法主要是通过在体外进行基因转移，筛选可表达外源基因的细胞，然后再转移到体内；体内法则是直接在体内改变与修复遗传物质。随着分子生物学、基因重组技术的发展，有关目的基因的获得方法已趋成熟，但是，目的基因的转移传递系统、目的基因的表达调控以及疗效和安全性还需进一步研究证实。目前，基因转移系统主要是两类：一类是由病毒介导的基因转移系统，主要包括逆转录病毒（Rt）、腺病毒（Ad）、疱疹病毒（HSV）和腺病毒相关病毒（AAV）载体等。Nnldini等开发出一种基于HIV的重组Rt载体，不需要辅助细胞，能广泛感染各种非分裂细胞，同时保留了能整合在宿主染色体上的特点。世界上第一例基因治疗所采用的载体即是Rt载体，治疗腺苷酸脱羧酶缺乏所致的严重联合免疫缺乏症（ADA-SCID）。另外一类是非病毒介导的基因转移系统，包括脂质体、分子偶联载体、基因枪和裸DNA等。　　另外，反义核苷酸技术也应用于基因治疗，尤其在抗乙肝病毒的基因治疗方面，包括反义DNA、反义RNA和核酶 RNA等。2001年，Robaczewska等首次通过静脉给予反义 DNA，选择性抑制北京鸭HBV在鸭肝脏中的复制和表达，证明了反义DNA在动物实验中的有效性。美国Viagene公司研究出一种被称为"艾滋病毒免疫制剂"，该药为一种鼠逆病毒与核心蛋白编码的基因序列和HIV表面抗原RNA结合产物，在小鼠和灵长类动物试验中确定该药能诱导出强的 HIV-特异性杀伤细胞。　　4 结束语　　基因工程技术使药品开发发生了根本性的转变。传统的药品开发方式是在大量的化学合成物质和微生物代谢产物中进行随机筛选，得到其中的有效成分作为新的药物。采用基因工程技术开发新药，是通过对致病机理的研究，找到那些可用于治疗目的的有效成分以及其编码基因，经过基因重组将其转入适当的载体，大量表达其有效成分作为治疗药物。同时，基因工程技术给药品生产技术带来了革命性变化。过去一些生产困难的产品，如激素、酶、抗体等一些生物活性物质，通过基因工程手段可以高质量、高收率地付诸生产，同时生产成本也大幅度降低，提高了患者的用药水平和生活质量。　　基因工程技术在传统医药不能有效治疗的一些疾病，如癌症、艾滋病、遗传病等的诊断、治疗和预防等方面提供了有效的新手段，并取得了一些重大的突破。如发现了致癌基因，可使癌症的早期诊断和治疗药物的开发成为可能。随着分子生物学和基因重组技术的发展，我们相信这些严重危害人类生命的疾病，在不久的将来会得到有效的预防和治疗。