黄芪对慢性肾脏病大鼠钙磷代谢及FGF23-Klotho轴的影响
肾脏在矿物质和骨代谢的过程中起关键作用,一方面,肾脏是激活活性维生素D最重要的器官;另一方面,肾脏是钙磷代谢过程中相关激素的重要靶器官。因此,慢性肾脏病(Chronic kidney disease,CKD)常伴矿物质和骨代谢的异常。CKD患者由于后期矿物质和骨代谢的失衡,常伴有血管中膜和内膜的加速钙化,而在透析患者中上述钙化进程进一步加速[1]。CKD血管钙化可导致心血管疾病(Cardiovascular disease,CVD)患病率,甚至死亡率的升高,以及患者生存质量的下降。近几年,慢性肾脏病-矿物质和骨异常(Chronic kidneydisease-mineral and bone disorder,CKD-MBD)正逐渐引起临床医师的普遍重视。在其发病机制方面,传统比较公认的有以下几个方面[2]:钙磷代谢紊乱、PTH代谢紊乱、维生素D代谢异常。而成纤维细胞生长因子23(Fibroblast growth factor-23,FGF23)作为调节骨及矿物质代谢的新型因子,依赖于Klotho并通过活化FGF受体(FGF-Rs),起到破坏1,25-(OH)2VitD合成并加速其降解的作用。本研究观察了FGF23-Klotho轴在慢性肾脏病大鼠钙磷代谢中的表达变化,以及黄芪对钙磷代谢和FGF23-Klotho轴表达的影响。
1 材料与方法
1.1 动物
SPF级健康雄性SD大鼠30只,体质量180~220 g,购自上海杰思捷实验动物有限公司,许可证号:SCXK(沪)2013-0006。饲养于中国药科大学玄武门校区实验动物中心。所有动物适应性喂养1周,自由摄取普通饲料和自由饮水。
1.2 试剂与仪器
腺嘌呤,购自南京裕成实验设备有限公司,批号:EZ2811A135。高磷饲料:含磷1.2%、钙1.8%,定制于南京青龙山动物繁殖场。大鼠甲状旁腺激素ELISA试剂盒、大鼠成纤维细胞生长因子-23 ELISA试剂盒、大鼠Klotho蛋白ELISA试剂盒及大鼠25羟基维生素D3 ELISA试剂盒均购自于南京赛亚生物科技有限公司。AllegraX-15R离心机,AU5800全自动生化仪,EVOS XL核心细胞成像系统,全波长扫描式多功能读数仪。
结果见图4。与对照组相比,模型组FGF23明显升高,黄芪组升高不明显,差异有统计学意义(P<0.05);与对照组相比,模型组Klotho蛋白浓度明显下降,黄芪组Klotho蛋白较模型组下降不明显,且差异有统计学意义(P<0.05);与对照组相比,模型组及黄芪组25(OH)D3均下降(P<0.01),但模型组与黄芪组之间无明显差异。
2.1 动物死亡情况
1.4 观察指标及方法
再次,要提升翻译教材质量,课本是学习的基础,而且中国学生有一定的盲信课本的缺点呢,因此,面对琳琅满目的教材,如何选择极其重要。这就需要广大编者,出版社,教师从实际问题出发,具体问题具体分析。切实根据翻译专业培养目标和学科特点,选择适合的教材。
见图2~3。正常组肾脏外观大小正常,颜色褐红,表面光滑;模型组体积明显增大,颜色苍白,表面可见腺嘌呤颗粒沉积;黄芪组肾脏外观较模型组红润,体积较模型组稍小(图2)。经ANOVA单因素方差分析后发现各组肾脏质量中模型组与对照组、黄芪组与模型组差异均有统计学意义(P<0.01)(表1)。光镜下对照组肾小球结构正常。模型组肾小球数目明显减少,肾小球结构紊乱,肾间质纤维化,肾小管扩张积水,腔内可见炎性细胞浸润及大量黑色腺嘌呤代谢物结晶沉积。与模型组比较,黄芪组正常肾小球数目较多,肾小管扩张程度降低,炎性细胞数量下降,腺嘌呤结晶减少(图3)。
1.4.3 生化学指标检测 给药前每组大鼠随机抽取3只,10%水合氯醛腹腔麻醉后采用心脏穿刺法采血2 mL,实验结束后处死并行腹主动脉采血,室温下静置2 h,待血液凝固后,以3 500 r/mim离心5 min,取上清液,全自动生化仪测定血肌酐(Serum creatinine,Scr)、血尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN)、血钙(Calcium,Ca)、血磷(Phosphorus,P),由江苏省中医院检验科完成。
1.4.4 酶联免疫吸附法测定大鼠PTH、FGF23、Klotho蛋白及25(OH)D3 采用双抗体夹心法测定各组大鼠血清样本,测定时样本在室温复融后严格按说明书进行。每份样本设3个复孔,取平均值。
1.5 统计学方法
慢性肾脏病(CKD)已成为威胁人类健康的主要疾病之一,CKD患者具有较高的心血管疾病的发病率和病死率,血管钙化为CKD心血管事件高发的主要原因。其中,高血磷被认为是CKD患者血管钙化的关键因素。Eddington等[6]对1203例非透析CKD患者进行前瞻性研究发现,血磷每升高1mg/dl,心血管死亡风险增加50%。FGF23作为新进发现的血磷的主要调节因子,当血磷水平升高时,FGF23由骨组织分泌入血,通过增加肾脏尿磷排泄和抑制维生素D的合成,实现对血磷的负向调控[7]。FGF23同样可以通过降低维生素D的水平来减少钙在肠道的吸收,最终导致血钙水平的降低[8]。然而,FGF23生理作用的发挥需要依赖于Klotho蛋白的协同作用。FGF23受体(FGF32 receptor,FGFR)是一种单次跨膜的酪氨酸激酶,表达于全身许多组织,当FGFR单独存在时,其与FGF23的亲和力较低,Klotho蛋白则作为辅助因子与FGFR结合,并明显增加FGFR与FGF23的亲和力。人体FGFR分布非常广泛,而Klotho蛋白的表达则相对局限,主要位于肾脏、甲状旁腺、脑内脉络丛以及垂体等处。在CKD早期,机体通过增加FGF23的表达来代偿肾单位减少所致的肾脏排磷能力的降低,而FGF23在Klotho蛋白的辅助下可以抑制维生素D合成并促进其分解。由于活性VitD3是Klotho的上调因子,其减少导致Klotho合成降低[9]。Kuro-o等[10]的实验表明Klotho蛋白表达缺陷小鼠表现为生长缓慢、步态紊乱、生殖器萎缩、动脉硬化、骨质疏松、糖和能量代谢异常、寿命缩短等表型变化。而Klotho主要表达在肾脏的远曲小管、甲状旁腺细胞和脑内脉络丛上皮细胞。
2 结果
30只SD大鼠随机分为对照组6只、模型组12只及黄芪组12只。制备慢性肾衰竭大鼠模型方法参考文献[3-4],并加以改良:实验第2~5周模型组及黄芪组大鼠均按照250 mg/kg给予腺嘌呤混悬液灌胃及含1.2%高磷饲料喂养,第6、7周改为腺嘌呤隔日灌胃。同时黄芪组用黄芪水煎剂灌胃治疗。对照组2~7周继续普通饲料喂养,并予等量0.9%生理盐水灌胃,其中第6、7周生理盐水改为隔日灌胃。共给药6周。生黄芪购自南京中医药大学附属医院,生药用10倍蒸馏水浸泡30 min后加蒸馏水煎煮2次,合并2次滤液,过滤浓缩为1.875 g/mL的生药。按人和动物体表面积换算公式:大鼠中药给药剂量依据人-大鼠体表面积换算(1∶6.25),并按临床成人用药量的4倍给药[5],12.5 g/(kg·d)。
对照组给药前心脏采血时死亡2只。模型组死亡1只,可能因灌胃时操作不当,误插入气管死亡。黄芪组死亡3只,可能为造模药物剂量相关的死亡。动物死亡率20%。
GB/T 13923―2006《基础地理信息要素分类与代码》标准(以下简称“民用分类代码”)规定了基础地理信息要素分类与代码,用以标识数字形式的基础地理信息要素类型,适用于基础地理信息数据采集、更新、管理、分发服务和产品开发,包括1∶500~1∶1 000 000比例尺的基础地理信息数据库建设与应用,各种专业信息系统的基础地理信息公共平台建设,不同系统间的基础地理信息交换与共享,以及数字化测图、编图和地图更新等。
自然环境在为人类提供多种多样的旅游产品时,也需要人类的保护。运用循环经济的理念,可以使人类与自然和谐共处。循环经济可以促进旅游业可持续发展,让自然生态与旅游业协调发展。循环经济在环境保护方面取得了一定效果,旅游开发者要在不断实践中找到更好的发展方式。
2.2 动物一般表现
正常组大鼠精神良好,活动正常,体型较大,毛色光泽。模型组大鼠毛色枯槁,散乱、脱毛,懒动,饮食饮水及排尿减少。黄芪组及模型组体质量逐渐下降(图1),但黄芪组毛发色泽及精神状态较模型组稍好。实验开始时模型组及黄芪组体质量与对照组相比,差异无统计学意义;实验结束时模型组及黄芪组体质量与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。
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注:第2周起模型组及黄芪组更换高磷饲料喂养
图1 各组大鼠每周体质量变化情况
2.3 肾脏外观及组织学病理检测
1.4.2 肾脏组织学病理检测 实验结束后处死大鼠并摘取肾脏后剥离肾组织经10%福尔马林固定后,常规石蜡包埋,切片,HE染色,镜下观察肾小球、肾小管及肾间质的改变。
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注:A.对照组;B.模型组;C.黄芪组
图2 各组大鼠肾脏外观比较
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注:A.对照组;B.模型组;C.黄芪组。箭头所指出为腺嘌呤结晶。
图3 各组大鼠肾脏组织学病理检测(HE,×100)
表1 各组大鼠体质量及肾脏质量比较
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组别原始体质量/g终末体质量/g肾脏质量/g对照组223.0±3.27364.0±3.001.26±0.09模型组218.2±15.35235.7±14.20∗5.88±0.78∗∗黄芪组215.6±7.98232.2±10.36∗4.58±1.14##
注:与对照组比较,*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较,#P<0.05,##P<0.01。
2.4 各组大鼠生化学指标比较 结果见表2。给药前各组大鼠血Scr、BUN、Ca、P、PTH之间差异无统计学意义。给药后模型组与对照组相比,模型组血Scr、BUN、Ca、P明显升高,PTH无明显升高,各项数据差异均有统计学意义(P<0.05~0.01);给药后黄芪组与模型组相比,黄芪组血Scr、BUN、Ca、P均有下降,PTH稍升高,且BUN、Ca、P指标差异有统计学意义(P<0.05~0.01)。给药前后黄芪组各项指标较模型组升高缓慢。
表2 各组大鼠生化学指标比较
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组别BUN/(mmol·L-1)给药前给药后Scr/(μmol·L-1)给药前给药后Ca/(mmol·L-1)给药前给药后P/(mmol·L-1)给药前给药后PTH/(pg·mL-1)给药前给药后对照组6.63±0.206.98±0.6013.15±1.7534.40±5.062.12±0.152.40±0.152.41±0.162.22±0.54219.81±6.58277.52±19.98模型组7.04±0.2999.09±25.76∗∗10.95±7.45210.05±40.78∗∗1.90±0.372.83±0.20∗2.50±0.483.45±0.60∗171.37±14.52206.76±25.78∗∗黄芪组6.86±0.3557.53±16.70##15.70±3.50176.91±59.791.97±0.172.60±0.19#2.37±0.192.68±0.63#216.37±15.94214.64±19.90
2.5 ELISA法检测大鼠FGF23、Klotho蛋白及25(OH)D3结果比较
1.4.1 一般情况 观察大鼠的体质量、精神状态、活动、饮食及饮水、皮毛、二便等情况变化。
1.3 分组及造模
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注:与对照组比较,
图4 各组大鼠给药前后血清FGF23、Klotho及25(OH)D3比较
3 讨论
应用SPSS19.0软件进行统计分析。计量资料以表示,组间比较采用One-way ANOVA检验,方差齐时组间两两比较用LSD检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
没有任何犹豫,秦铁崖心意已决,代江云飞出征。若能获胜,算得上功成名就,一生无憾;倘若落败负伤,也没什么,正好告老还乡。捕头这项苦差,吃的是英雄饭,年纪大了谁都会力不从心。当然,秦铁崖并不老,正值壮年。
(3) 大双边供电模式下4列AW0车同时起动电流上升率(0.36 A/ms)未达到电流增量保护的整定值(25 A/ms)。
以往的民间文学(民间故事)经典研究,都是立足于民间文学学科本位,通过对民间文学对象的题材内容、结构形态等认识达到外在的、主观的、实然的实践目的,即对“真”的追求。此种研究从独立于、优越于实践的认识主体立场出发,无论怎样归纳诸种价值范畴,其思考结果都必然是外在的,都依赖于民间文学对象的外在语境。一旦外在语境消失,就丧失了实然(真)的发生条件与存在理由,在认识主体(研究者)眼中,民间文学即面临着消亡命运。
本实验结果可见模型组大鼠较对照组大鼠体质量下降、肾脏增大,血Scr、BUN明显升高,肾脏HE切片可见慢性肾衰大鼠模型造模成功。从治疗效果上看,黄芪组大鼠肾脏体积较模型组大鼠相对减小,差异有统计学意义;血Scr、BUN、Ca、P均有下降,PTH无明显升高,提示黄芪能够显著延缓CKD大鼠的肾功能进展,且明显改善CKD后期出现的高钙、高磷及继发性甲状旁腺功能亢进。肾脏组织学可见,黄芪组大鼠正常肾小球数目较多,肾小管扩张程度降低,炎性细胞数量下降,腺嘌呤结晶减少,提示黄芪对于改善CKD肾脏组织病理变化有一定作用。模型组及黄芪组较对照组而言,25(OH)D3降低符合临床上慢性肾脏病患者随着肾功能恶化血25(OH)D3逐渐减低。本文研究中给药后黄芪组较模型组FGF23升高不明显,Koltho蛋白升高,且差异有统计学意义,提示黄芪可以抑制CKD病程中FGF23的升高,减少Klotho蛋白的损伤,但其具体分子机制有待进一步研究。
Klotho蛋白的发现似乎也印证了中医学“肾主生长发育和生殖”的理论。中医虽无慢性肾脏病、钙磷代谢异常之名,但根据其临床表现及发病规律,本研究认为其发病机制为脾肾亏虚,气血运行不畅,随病情进展加重又易产生湿热、瘀血、浊毒等邪实之患。因此,针对以上病机治疗CKD当补脾益肾、补气养血,兼清利泄浊、活血祛瘀。对于CKD钙磷代谢异常的防治,现代医学目前多集中在对其危险因素的控制,同时合并对症治疗。目前中医中药对于CKD钙磷代谢的研究不多。黄芪具有补气升阳,固表止汗,利尿消肿,生津养血等功效,现代药理研究证实,黄芪水煎液有保护肾脏、消除蛋白尿和利尿作用[11],有研究用淫羊藿、黄芪、大黄的中药复方制剂对残余肾大鼠模型进行干预后发现,其中药复方干预能上调模型组大鼠肾脏Klotho mRNA及Klotho蛋白的表达,降低BUN、Scr,从而改善模型大鼠肾功能、减轻病理损害[12]。黄芪具有生津养血,补气升阳,利尿消肿等功效,本实验结果提示黄芪能减轻CKD病程中钙磷代谢异常,抑制FGF23过高表达,上调CKD大鼠Klotho蛋白的表达,延缓CKD大鼠肾功能进展,减轻肾脏病理损害,改善钙磷代谢。由于CKD钙磷代谢异常发病机制的复杂性,对于黄芪如何上调Klotho蛋白的表达还需进一步研究。
30例患者共有22例半月板损伤,8例没有半月板损伤,半月板损伤合并胫骨平台骨折的比例是73.3%。有19例半月板损伤是在红区和红白交界处,有2例使半月板后角损伤,因器械操作困难无法修复,其余均是一期修复。患者接受12至18个月随访,有1例皮肤坏死,出现瘢痕愈合,其余均愈合良好。
黄芪能减轻CKD病程中钙磷代谢异常,抑制FGF23过高表达,上调CKD大鼠Klotho蛋白的表达,延缓CKD大鼠肾功能进展,减轻肾脏病理损害,改善钙磷代谢,其机制尚需进一步研究。
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